細胞膜表達的hlag誘導免疫耐受性樹突狀細胞的產生論文

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1、細胞膜表達的HLAG誘導免疫耐受性樹突狀細胞的產生論文周浩黎緯明張敏劉崢嶸鄒萍【摘要】為了探討體外誘導免疫耐受性樹突狀細胞(dendriticcell,DC)產生的方法及其機制，利用人HLAG1真核表達載體轉染K562細胞并與DC共培養(yǎng)后，用流式細胞術檢測DC表面CD80、CD86、ILT3和ILT4分子表達情況，同時采用氚胸腺嘧啶核苷（3HTdR）摻入法檢測DC對T細胞功能的影響。結果表明，膜表達的HLAG1分子與樹突狀細胞作用后，DC表面免疫共刺激分子CD80、CD86表達下調，而抑制性分子ILT3

2、、ILT4表達上調。HLAG1作用后DC異基因抗原誘導淋巴細胞增殖的活性明顯下降。結論：HLAG1分子可以在體外條件下，下調DC表面免疫共刺激分子水平.freelbraneBoundHLAGAbstractInordertostudyhoechanism,theK562cellstransducedmunologicalchanges,suchasmembranemoleculesCD80,CD86,ILT3andILT4expressionlevelsetry.Allogeneicproliferat

3、ionofperipheralbloodmononuclearcells(PBMNC)ixedlymphocytereaction.TheresultsshoulatetheallogenicPBMNC.ItisconcludedthatthemembraneboundHLAGcanupregulateexpressionofinhibitoryreceptorsILT3andILT4,inducingtolerogenicDCinvitro,ayprovideanovelstrategyfortransp

4、lanttoleranceinduction.Keyphocyte;immunetolerance移植排斥所導致的移植物抗宿主病（GVHD）是骨髓移植領域的難題。目前臨床免疫抑制劑的應用雖然可以顯著降低急性GVHD的發(fā)生，但是慢性GVHD損害的發(fā)生仍然難以克服。誘導受者外周免疫耐受被認為可能成為解決移植后慢性GVHD的有效途徑［1］。樹突狀細胞（dendriticcell，DC）是體內功能最強的專業(yè)性抗原呈遞細胞，是活化初始CD4+T細胞最有效的抗原呈遞細胞。近年來，人們逐漸認識到DC在外周免疫耐受中的作用，并

5、尋找誘導免疫耐受性樹突狀細胞產生的有效途徑［2］。免疫耐受性樹突狀細胞膜上高表達ILT3和ILT4分子，它們的可能配體是HLAG［3］。研究發(fā)現(xiàn)，HLAG促進心臟移植后的外周免疫耐受狀態(tài)的產生，其機制可能與誘導樹突狀細胞耐受有關［4］。本實驗希望通過對HLAG誘導DC免疫耐受的機制的研究，探討誘導免疫耐受性DC產生的新的有效方法。材料和方法主要試劑、細胞株及HLAG1真核表達質粒RPMI1640培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液、G418、TRIZOL一步法提取RNA試劑及逆轉錄試劑盒均購于Gibco公司，Lipo

6、fectamine2000脂質體轉染試劑盒購于Invitrogen公司，小牛血清購于杭州四季青公司。慢性粒細胞白血病細胞株K562、絨毛膜癌細胞株JEG3細胞來源于ATCC，培養(yǎng)于含15%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中。包括人HLAG1全長cDNA的真核表達質粒由CaroleOber博士惠贈。K562細胞的轉染及藥物篩選脂質體介導的真核細胞轉染技術參照Lipofectamine2000脂質體轉染試劑盒說明進行。轉染細胞在800μg/ml濃度G418條件下篩選穩(wěn)定株。穩(wěn)定轉染細胞株表示為K562HLA

7、G1，轉染空載體的細胞株表示為K562RSV?？贵w和流式細胞術小鼠抗人HLAG1單克隆抗體(MEMG/9)購自BioVender公司。小鼠抗人HLADR、CD1a、ILT3、ILT4、CD80、CD86抗體，PE標記小鼠抗人CD1a抗體均購自RD公司。FITC標記山羊抗小鼠IgG抗體、山羊抗小鼠IgG免疫磁珠購自晶美公司。流式細胞術分析前，將細胞與含20%人血清的PBS作用以封閉Fc受體。并用同型對照抗體以系統(tǒng)性消除非特異性結合。流式細胞分析采用CellQuest軟件。外周血來源樹突狀細胞培養(yǎng)及細胞的共

8、培養(yǎng)取新鮮的人肝素抗凝外周血20ml，用PBS以1∶1的比例稀釋后沿離心管壁緩慢加到淋巴細胞分離液上，2000×g離心20分鐘后取白膜層細胞，用PBS以1500×g離心10分鐘洗滌2次，并用RPMI1640以1000×g離心10分鐘，洗滌1次，最后用含10%(v/v)胎牛血清RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸細胞，以2×106cells/ml細胞濃度加到24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml。放置37