青霉素效價(jià)的生物測(cè)定

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1、青霉素效價(jià)的生物測(cè)定【目的】1.了解用杯碟法測(cè)定抗生素效價(jià)的原理。2.掌握青霉素效價(jià)生物測(cè)定的具體操作步驟與方法。【概述】抗生素的抗菌特性決定了它的醫(yī)療價(jià)值，因此，利用他們各自的抗菌活性來(lái)測(cè)定其效價(jià)有著重要的意義。效價(jià)的測(cè)定法有：液體稀釋法、比濁法和擴(kuò)散法等。本實(shí)驗(yàn)采用國(guó)際上最常用的杯碟擴(kuò)散法來(lái)測(cè)定青霉素的效價(jià)。測(cè)定時(shí)，將規(guī)格完全一致的不銹鋼小管（即牛津小杯）置于含敏感菌的瓊脂平板上，并在牛津小杯中加入已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)青霉素溶液和未知濃度的青霉素發(fā)酵液。于是，抗生素就自牛津小杯處向平板四周擴(kuò)散，在抑菌濃度所達(dá)范圍內(nèi)敏感菌的生長(zhǎng)被抑制而出現(xiàn)

2、抑菌圈。在一定的范圍內(nèi)，抗生素濃度的對(duì)數(shù)值與抑菌圈直徑呈線性關(guān)系。因此，只要將被測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品的抑菌圈直徑進(jìn)行比較，就可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得未知樣品的抗生素效價(jià)值，為科學(xué)實(shí)驗(yàn)或臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)?！静牧虾推髅蟆竣啪N：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus），產(chǎn)黃青霉（Penicilliumchrysogenum）。⑵培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（作生物測(cè)定用時(shí)，平板應(yīng)分上下兩層，上層需另加0.5%葡萄糖）。⑶試劑①1%pH6磷酸緩沖液：K2HPO40.2g(或K2HPO4·3H2O0.253g)，K2HPO40.8g，蒸餾水1

3、00ml。②0.85%Nacl生理鹽水溶液。③芐青霉素鈉鹽：1.667U/mg（1U即1國(guó)際單位，等于0.6ug）。⑷其他：牛津小杯[不銹鋼小管，內(nèi)徑（6+0.1）mm，外徑（8+0.1）mm，高（10+0.1）mm]，培養(yǎng)皿（直徑90mm，深20mm；大小一致，皿底平坦），試管、滴管、移液管（5、1ml）及大口10ml移液管等?！痉椒ê筒襟E】1.敏感菌懸液的制備⑴保藏與傳代：將測(cè)定用的金黃色葡萄球菌在新鮮斜面培養(yǎng)基上傳代并保存。注意測(cè)定用敏感菌應(yīng)每隔3周傳代一次，菌種可在37℃溫箱培養(yǎng)18～20h后，再在室溫下置放3～4h，使菌種斜面

4、產(chǎn)生良好的色素，然后將其置于4℃冰箱保存。⑵活化：在使用前先將供試菌株在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)傳代3～4次，使菌種充分恢復(fù)其生理性狀。⑶制備懸液：將活化的敏感菌斜面，用0.85%生理鹽水洗下，經(jīng)離心后去除上清液，再用生理鹽水洗滌1~2次，并將其稀釋至一定濃度的懸液。2．青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制（1）青霉素標(biāo)準(zhǔn)母液：準(zhǔn)確稱取純芐青霉素鈉鹽15~20mg,，溶液在一定量的0.2mol/LpH6磷酸緩沖液中，使成2000U/ml的青霉素溶液，然后保持冷藏存放。（2）青霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液：使用時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)母液配成10U/ml青霉素標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定液，按表I-15-5-加

5、入青霉素標(biāo)準(zhǔn)母液，即配成不同濃度的青霉素標(biāo)準(zhǔn)液。表Ⅰ—15—5—①不同濃度標(biāo)準(zhǔn)青霉素液的配法試管編號(hào)10U/ml工作液量/mlPh6磷酸鹽緩沖液/ml青霉素含量/(U·ml-1)1234560.40.60.81.01.21.49.69.49.29.08.88.60.40.60.81.01.21.43.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（1）倒底層培養(yǎng)基：取無(wú)菌培養(yǎng)皿16套，每皿移入20ml牛肉膏蛋白胨底層瓊脂培養(yǎng)基，置水平待凝備用。（2）鋪含菌上層培養(yǎng)基：將裝在三角瓶中的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（100ml）融化，待冷卻到60℃左右時(shí)再加入60%葡萄糖液12

6、ml和金黃色葡萄球菌菌液3～5ml（加入菌液的濃度應(yīng)控制在使1U/ml青霉素溶液的抑制菌圈直徑在20～24mm），充分混勻后，用大口移液管吸取4ml于底層平板上迅速鋪滿上層，然后移置水平位置待凝備用。（3）放牛津小杯：待上層充分凝固后，在每個(gè)瓊脂板上輕輕放置4支牛津小杯，其間距應(yīng)相等，如圖所示：（4）滴加標(biāo)準(zhǔn)樣品液：用無(wú)菌潔凈移液管滴加標(biāo)準(zhǔn)樣品液，每一稀釋度應(yīng)更換一支移液管，每支牛津小杯中的加量為0.2ml。或者用帶滴頭的滴管加樣品液，加夜量如圖所示，與杯口水平為準(zhǔn)。每一稀釋度做3個(gè)重復(fù)。（5）培養(yǎng)：待樣品加畢后，最好換上無(wú)菌素?zé)缮w（

7、吸濕性號(hào)，在蓋內(nèi)不易形成水滴）做培養(yǎng)皿的蓋子，并將平板置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)18～24h后觀察測(cè)定結(jié)果。（6）測(cè)量與計(jì)算：移去測(cè)定培養(yǎng)皿的素?zé)缮w，再將牛津小杯移去，精確地測(cè)量各稀釋度的青霉素的抑制圈直徑（用圓規(guī)兩腳的針尖測(cè)量可提高精度）并記錄于下表中。皿號(hào)青霉素效價(jià)/(U·ml-1)抑菌圈直徑/mm平均值/mm校正值/mm1U/ml青霉素抑菌圈直徑/mm平均值/mm校正值/mm10.42340.65670.889101.21112131.414151U/ml青霉素抑菌圈直徑總平均值=（mm）計(jì)算步驟：①算出各組（即各劑量）抑制圈的平均直徑

8、。②算出各組1U/ml的抑制圈平均直徑。③統(tǒng)計(jì)15套培養(yǎng)皿中1U/ml的抑制圈平均值。④以1U/ml抑制圈的總平均值來(lái)校正各組的1U/ml抑制圈的平均值，即求得各組的校正值。⑤以各組1U/ml的抑制圈的校正