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《抗原致敏樹突狀細胞誘導(dǎo)cik對胃癌細胞殺傷作用的研究論文》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、抗原致敏樹突狀細胞誘導(dǎo)CIK對胃癌細胞殺傷作用的研究論文胡廷輝應(yīng)敏剛鄭秋紅龔福生謝云青樹突狀細胞（dendriticcell，DC）是已知功能最強的抗原呈遞細胞，是機體T淋巴細胞特異免疫應(yīng)答的直接啟動和調(diào)控者，在機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。在體外培養(yǎng)DC并用腫瘤抗原致敏后，攜帶腫瘤抗原信息的DC，在體內(nèi)外激活針對該腫瘤細胞的特異性殺傷細胞。本試驗在體外用人胃癌細胞SGC提取腫瘤抗原致敏DC后誘導(dǎo)CIK，通過其對SGC的殺傷作用的研究為DC治療胃癌的研究提供理論及試驗依據(jù)。1材料與方法1.1主要試劑SGC由福建省腫瘤醫(yī)院分子生物學(xué)研究室提供；rhIL?
2、鄄2、rhIL?鄄4、CD3mAb購自Peprotech公司；rhGM?鄄CSF、Ficoll淋巴細胞分離液購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院；胎牛血清(超級)購自杭州四季青生物制品公司；人AB血清由福建省血液中心提供；1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；FITC標(biāo)記的小鼠抗人CD83、HLA?鄄DR、CD14、CD86及同亞型對照抗體購于晶美生物工程有限公司。1.2方法1.2.1SGC的培養(yǎng)SGC在5％CO2、37℃條件下，用含有10％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。1.2.2腫瘤細胞總蛋白的獲取將培養(yǎng)貼壁腫瘤細胞用胰酶消化懸浮.freelin超速離心90min，取上
3、清。濃縮透析，調(diào)整蛋白濃度為25mg/ml，經(jīng)0.22μm濾膜濾過除菌，－80℃保存。1.2.3DC的培養(yǎng)1無菌條件下采集的正常人抗凝外周全血，經(jīng)淋巴細胞分離液梯度離心，獲取單個核細胞，用含10%AB血清的RPMI1640懸浮細胞，調(diào)整細胞濃度至5×107/ml，加1ml至6孔板內(nèi)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，吸掉上清，用培養(yǎng)液洗去非黏附細胞，獲得貼壁細胞，每孔再加入3ml含有rhIL?鄄4（500U/ml）及rhGM?鄄CSF（500μg/ml）的10%AB血清的RPMI1640培養(yǎng)液，2~3d半量換液1次。1.2.4抗原負載DC及表型鑒定將上述培養(yǎng)5d的DC用含有rh
4、IL?鄄4（500U/ml）及rhGM?鄄CSF（500μg/ml）的10%AB血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×106/ml，向6孔板內(nèi)加入2ml的細胞，每孔加入腫瘤細胞總蛋白1ml（25mg），于第8d收集懸浮細胞為抗原致敏的DC。對照組加入無血清RPMI1640培養(yǎng)液1ml，于第8d收集懸浮細胞為空白的DC。分別收集第1d、第5d及第8d抗原致敏的DC，用流式細胞儀檢測DC表面分子HLA?鄄DR、CD83、CD86、CD14表達。1.2.5CIK的培養(yǎng)2同前法從外周血中獲取單個核細胞，用含10%AB血清的RPMI1640懸浮細胞，37℃、5%
5、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，取懸浮細胞，調(diào)整細胞數(shù)為1×106/ml，用含有IL?鄄2(250U/ml)、CD3mAb(50μg/L)的10%AB血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，2~3d半量換液1次至第8d。試驗組用將其分別與空白的DC及抗原致敏的DC按10：1比例相混，用含有IL?鄄2(250U/ml)、CD3mAb(50μg/L)的10%AB血清的RPMI1640培養(yǎng)液在6孔板內(nèi)培養(yǎng)。對照組僅用含有IL?鄄2(250U/ml)、CD3mAb(50μg/L)的10%AB血清的RPMI1640培養(yǎng)液在6孔板內(nèi)培養(yǎng)。5d后分別獲取抗原致敏DC誘導(dǎo)CIK，空白的DC
6、誘導(dǎo)CIK及CIK為效應(yīng)細胞。1.2.6混合淋巴細胞反應(yīng)（MLR）試驗組收集成熟經(jīng)抗原致敏及空白的DC，用含有IL?鄄2(250U/ml)、CD3mAb(50μg/L)10%AB血清的RPMI1640調(diào)整細胞數(shù)為1×106/ml。收集同時期培養(yǎng)的CTK用同樣的培養(yǎng)液調(diào)整細胞數(shù)為1×107/ml。將100μlCIK分別與100μl經(jīng)抗原致敏及空白的DC在96孔培養(yǎng)板中混合培養(yǎng)。對照組100μlCIK加入100μl含有IL?鄄2(250U/ml)、CD3mAb50μg/L10%AB血清的RPMI1640繼續(xù)培養(yǎng)。72h后加入四甲基偶氮唑藍（MTT）10μg，繼續(xù)培
7、養(yǎng)4h，離心棄去孔內(nèi)上清，每孔加入150μl二甲基亞砜（DMSO）震蕩10min，待結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀在570nm處測OD值（A），每組設(shè)3個復(fù)孔，取均值按下式計算：刺激指數(shù)SI=A實驗孔/A對照孔×100％1.2.7細胞殺傷試驗用MTT比色法測定抗原致敏DC誘導(dǎo)CIK，空白的DC誘導(dǎo)CIK及CIK對SGC細胞的殺傷活性，效靶比為5：1、10：1、20：1。調(diào)整細胞至所需濃度，各取100μl的效靶細胞懸液加入96孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入四甲基偶氮唑藍（MTT）10μg，繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心棄上清，每孔加入150μl二甲基亞砜（
8、DMSO）震蕩10min，待結(jié)晶物充分
