抗原沖擊致敏樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)特異性ctl殺傷jurkat細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究論文

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1、抗原沖擊致敏樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)特異性CTL殺傷Jurkat細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究論文.freelphocytesonJurkatCellsInVitroAbstractThisstudyedtoinvestigatetheeffectsoftumorantigen-loadeddendriticcells(DC)stimulatingthespecificcytotoxicTlymphocytes(CTL)onJurkatcellsinvitro.Peripheralbloodmononuclearcellsnormalhuma

2、nheparinizedblood，theadherentmonocytesacrophagecolonystimulatingfactor(GM-CSF)，interleukin-4(IL-4)，alphatumornecrosisfactor(TNF-α)andsCD40L，DCsostsuspendedcellsexhibiteddistinctivemorphologicalfeaturesofDCulateproliferationofallogeneiclymphocytes.Undertheeffec

3、tor∶targetratioof20∶1，CTLsderivedfromculturesculturesculturesonocytescultureorantigen-pulsedDCcaninduceefficientandspecificanti-tumorimmunity，mayplayagreatroleinclinicaltherapyforleukemia.Keyia樹突狀細(xì)胞(dendriticcell，DC)是已知體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原呈遞細(xì)胞，最大特點(diǎn)是能刺激初始型T細(xì)胞活化和增殖，是特異性免

4、疫應(yīng)答的始動(dòng)者，DC在抗腫瘤免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。但大多數(shù)白血病患者有DC功能缺陷，在體外擴(kuò)增DC并誘導(dǎo)白血病特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞發(fā)揮最大限度特異性抗白血病效應(yīng)，使消除白血病病灶、延長(zhǎng)患者壽命、防止復(fù)發(fā)成為可能。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用細(xì)胞因子rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α及rhsCD40L等由健康人外周血單核細(xì)胞(monocytes)誘導(dǎo)活化出DC，使其分別負(fù)載Jurkat細(xì)胞凍融抗原及-CSF、rhIL-4、rhTNF-α、rhsCD40L均購(gòu)自美國(guó)Cytolab公司；鼠抗人FITC-CD14、CD1a、CD

5、40、CD80、CD83、PE-CD86等流式細(xì)胞熒光標(biāo)記抗體（美國(guó)eBioscience公司產(chǎn)品）；LDH-Cytotoxicity分析(美國(guó)Biovision公司產(chǎn)品)；NikonTE2000-U倒置顯微鏡(日本Nikon產(chǎn)品）；Model680型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品）;FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BectonDickinson公司產(chǎn)品）。急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株（Jurkat）為I1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3×109/L，接種于25ml塑料培養(yǎng)瓶，在5%CO2飽和濕度、37℃條件下

6、孵育3小時(shí)，吸出非黏附細(xì)胞，用預(yù)熱的培養(yǎng)液洗去未貼壁的細(xì)胞，即獲得貼壁的單核細(xì)胞（monocytes）。加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液（含rhGM-CSF100μg/L，rhIL-450μg/L，2mmol/LL-谷氨酰胺），在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)，第3、5天半量換液，同等量添加上述細(xì)胞因子，在第5天收集懸浮細(xì)胞于6孔板培養(yǎng)，并添加rhTNF-α20μg/L，rhsCD40L2mg/L。第7天收獲細(xì)胞，瑞氏染色并攝片，流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫表型。混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)收集上述方法中獲得的非貼壁單

7、個(gè)核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞），加入RPMI1640(含rhIL-220000U/L低濃度培養(yǎng))，每2-3天半量換液，培養(yǎng)7天作為反應(yīng)細(xì)胞;刺激細(xì)胞為向DC誘導(dǎo)的細(xì)胞，收集培養(yǎng)第7天的DC懸液，離心。同種異基因混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)組為實(shí)驗(yàn)組，與同種同基因淋巴細(xì)胞反應(yīng)組為對(duì)照組。MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖活性：DC與淋巴細(xì)胞比例分別為1∶10，1∶20，1∶100（淋巴細(xì)胞濃度為2×109/L），各0.1ml接種于96孔板，混和孵育72小時(shí)，加MTT10μl(5μg/L)再作用4小時(shí)，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490nm的A值。Jurkat細(xì)胞

8、凍融抗原制備和FPNAPYL，由上海生工公司合成，HPLC純度檢測(cè)95%，分子量1108.3，取5mg溶于5mlPBS中，分裝，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。在DC培養(yǎng)的第4天每毫升培養(yǎng)體系實(shí)驗(yàn)組分別加Jurkat細(xì)胞凍融抗原及I1640培養(yǎng)液洗滌，重新添加細(xì)胞因子繼續(xù)培養(yǎng)。IL-12含量的檢測(cè)及活化T細(xì)胞免疫表型檢測(cè)收集誘導(dǎo)培養(yǎng)的第7天DC上清，用ELISA法定量