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《烏頭堿體內(nèi)代謝產(chǎn)物分析方法的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、烏頭堿體內(nèi)代謝產(chǎn)物分析方法的研究項目完成人員：馬辰李慧義李文東劉愛茹李農(nóng)項目完成單位：國家藥物及代謝產(chǎn)物分析研究中心摘要運用體內(nèi)與體外代謝的方法對烏頭堿的代謝轉(zhuǎn)化作了研究，體外代謝運用大鼠肝微粒體體外溫孵法，優(yōu)化了溫孵體系，建立了反相HPLC-DAD分離檢測烏頭堿及其體外代謝產(chǎn)物的分析方法；體內(nèi)代謝運用對大鼠灌胃給藥，收集0-8h、8-24h、24-48h三個時段的尿液，通過冷凍干燥有機溶劑提取的前處理方法，HPLC-DAD檢測，建立了體內(nèi)烏頭堿的分析方法，確定了烏頭堿一標志性的代謝產(chǎn)物，LC-MS分析初步確定其結(jié)構(gòu)，同時對烏頭堿水解產(chǎn)物及不穩(wěn)定性產(chǎn)物作了研究，通過LC-MS分析，其
2、水解產(chǎn)物為烏頭堿8位酯鍵水解產(chǎn)物與烏頭胺，不穩(wěn)定性產(chǎn)物為8位的乙酰氧基結(jié)合一個氫掉一個乙酸基的產(chǎn)物。應(yīng)用所建立的方法，對血、尿中烏頭堿的分布進行了測定。一．烏頭堿液相色譜條件的建立與血尿中的分布烏頭堿、次烏頭堿及其代謝產(chǎn)物的分子中均含有N原子，有較大極性，在分離中要考慮其結(jié)構(gòu)特性。復(fù)方中的成分復(fù)雜，為了獲得烏頭堿與次烏頭堿及其它組分的分離，曾選用乙腈-水-三乙胺系統(tǒng)，乙腈對被測組分的洗脫力強，出峰快，分離不好。甲醇-水-三乙胺系統(tǒng)，使化合物之間及與雜質(zhì)有理想的分離效果。對于堿性化合物來說，流動相的pH值對分離效果的影響很大。為此考察了0.05%，0.04%，0.02%的三乙胺對分離的
3、影響，確定0.04%三乙胺可以滿足烏頭堿、次烏頭堿與雜質(zhì)峰的分離，且得到較好的峰形。使用的流動相為弱堿性，對色譜柱的破壞較大，因此采用流動相中加入少量酸，經(jīng)比較，在100ml流動相中加入0.5ml冰醋酸時，可使分離達到目的，并使流動相的pH值在色譜柱的適合范圍內(nèi)。根據(jù)以上條件的考察，確定甲醇：0.04%三乙胺：冰醋酸（60：40：0.5）為流動相，測定復(fù)方酒劑中烏頭堿與次烏頭堿的含量。烏頭堿與次烏頭堿乙醇溶液的紫外吸收光譜表明，二者的最大吸收峰均為240nm。因此，選擇240nm作為檢測波長。大鼠口服給藥，取血清，用3％高氯酸溶液超聲提取3次后，冷凍干燥后，用乙酸乙酯提取3次，蒸干，
4、用甲醇溶解，液相色譜測定，給藥3h，血清中烏頭堿含量為1.3mg/mL，第二天取血，未檢測到烏頭堿。給藥后收集24h尿液，冷凍干燥后，用乙酸乙酯提取316次，蒸干，用甲醇溶解，液相色譜測定，尿中的烏頭堿達15.1mg/mL，24－48h尿液降為1.1mg/mL。測定結(jié)果表明，血中烏頭堿很快檢測不到，且其濃度較尿中濃度低，因此尿中鑒定烏頭堿中毒更有實際意義。二．烏頭堿水解產(chǎn)物及不穩(wěn)定性產(chǎn)物研究1.試劑的配制烏頭堿標準溶液：精密稱取1mg烏頭堿，置5mL容量瓶中，用MeOH定容；精密稱量1mg烏頭堿，置5mL容量瓶中，用H2O溶解（不能完全溶解）。水解樣品的配制：取2mg烏頭堿對照品，加
5、甲醇0.5mg/mL的溶液；取此溶液2mL,加一滴稀鹽酸；同樣取2mL，不加稀鹽酸。取2mL烏頭堿對照品水溶液（0.5mg/mL），加一滴稀鹽酸，同樣取2mL烏頭堿對照品水溶液（0.5mg/mL）不加稀鹽酸。將這四個樣品于沸水浴中3h，充分水解。取2mL烏頭堿對照品水溶液（0.5mg/mL），加適量MeOH使不溶物溶解。將該樣品于37℃水浴1.5h后取出。2.水解樣品的HPLC-DAD分析與LC-MS分析將水解完的樣品進行HPLC-DAD分析，色譜條件同前，通過譜圖有相關(guān)峰出現(xiàn)，又結(jié)合LC-MS測定結(jié)果進行分析，烏頭堿甲醇溶液不加酸水解的HPLC色譜圖，與原藥烏頭堿比較，其中tR為1
6、4.6min為烏頭堿的色譜峰，tR為12.8min為烏頭堿N去乙基水解產(chǎn)物，tR為9.0min為烏頭堿8位酯鍵的水解產(chǎn)物，tR為5.6min為苯甲酸的色譜峰，該苯甲酸是由烏頭堿的8位水解產(chǎn)物在14位進一步水解而掉下的一個苯甲酸，所得烏頭胺不含有紫外吸收的官能團，紫外檢測器檢測不出，質(zhì)譜圖中可以體現(xiàn)。烏頭堿標液（MeOH與H2O混溶）于37℃水解1.5h的HPLC-DAD色譜圖，tR10.5min的色譜峰為烏頭堿的不穩(wěn)定性產(chǎn)物，通過其質(zhì)譜圖解析，初步其為烏頭堿8位乙酰氧基與15位的氫結(jié)合掉一個乙酸基的產(chǎn)物。16以下為烏頭堿水解產(chǎn)物及不穩(wěn)定性產(chǎn)物結(jié)構(gòu)示意圖烏頭胺烏頭堿8位水解產(chǎn)物烏頭堿不
7、穩(wěn)定性產(chǎn)物烏頭堿三．烏頭堿體外代謝研究1.動物的誘導(dǎo)與肝微粒體的制備Wistar種大鼠，腹腔注射苯巴比妥生理鹽水溶液60mg/kg，每天一次，連續(xù)三天按文獻報道的二次離心法制備肝微粒體，用Lowry法測定蛋白含量。162.溫孵體系的優(yōu)化依據(jù)烏頭堿的結(jié)構(gòu)特點及已有的文獻工作，設(shè)計了烏頭堿的有氧大鼠肝微粒體體外溫孵體系，該體系組成為：大鼠肝微粒體（Microsomeprotein）、NADP、NADH、G-6-PDH、G-6-P、Mg2+。大鼠肝微粒體體外溫孵
