家畜布魯氏菌病血清學(xué)平板試驗(yàn)(pat)

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1、家畜布魯氏菌病血清學(xué)平板試驗(yàn)（PAT）?一、應(yīng)備有下列材料：1.受檢血清：受檢血清必須新鮮,無(wú)溶血現(xiàn)象、腐敗現(xiàn)象、氣味。2.在實(shí)驗(yàn)前血清必須置于溫室中，使其達(dá)到20℃左右。3.抗原：由獸醫(yī)生物藥品廠生產(chǎn)供應(yīng)。本抗原由加熱殺死的布魯氏菌菌體經(jīng)染色制備而成的淡藍(lán)色懸浮液?？乖旧沓霈F(xiàn)凝集者應(yīng)廢棄。使用前應(yīng)充分振蕩，并使其溫度達(dá)到20℃左右。4.陰、陽(yáng)性血清：由獸醫(yī)生物藥品廠生產(chǎn)供應(yīng)，本方法所用的陰、陽(yáng)性血清與試管凝集試驗(yàn)法相同。二、操作方法：1.備一方形潔凈的玻璃板：劃成25個(gè)方格，橫數(shù)5格，縱數(shù)5格，每格四平方公分，第一列各格寫下血清號(hào)碼。2.用0.2毫升滅菌吸管按下列劑量加受檢血

2、清于任何一行（橫格）的各格中：第一格0.08毫升，第二格0.04毫升，第三格0.02毫升，第四格0.01毫升。（如下表）血清號(hào)第一格第二格第三格第四格血清量（毫升）10.080.040.020.0120.080.040.020.0130.080.040.020.0140.080.040.020.01由于本試驗(yàn)所需血清量較少，因此，在操作過(guò)程中要求嚴(yán)格，應(yīng)盡可能減少誤差，最好滴出血清前用濾紙片擦去吸管表面沾附的血清。3.加平板反應(yīng)抗原原液0.03毫升于上述各血清量中，并用牙簽或細(xì)鐵絲混勻，使抗原和血清推開，面積直徑約2—3公分的圓形。由血清量最少的一格（即第四格）混起，每份血清用一

3、根牙簽，用過(guò)的牙簽要放固定容器中，工作完畢后集中燒毀。若用細(xì)鐵絲作混合，每份血清混勻后應(yīng)用酒精棉花擦凈，然后再作另一份血清的混合。4.混合完畢，將玻璃板置于酒精燈火焰或凝集反應(yīng)箱上，均勻加溫，使達(dá)到30℃左右，并輕輕搖動(dòng)玻板，使血清與抗原混合液呈緩慢的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，以保證充分混合。5—8分鐘內(nèi)記錄反應(yīng)結(jié)果。5.每次試驗(yàn)用1—2份已知陰性血清和1—2份陽(yáng)性血清作平板凝集反應(yīng)，以資對(duì)照。6.按下列標(biāo)準(zhǔn)用加號(hào)記錄反應(yīng)強(qiáng)度“?！背霈F(xiàn)大的凝集片或小的顆粒物，液體完全透明，即100%凝集?！?++”有明顯的凝集片，液體幾乎全部透明，即75%凝集?！?+”有可見的凝集片，液體不甚透明，即50%凝集

4、?！?”液體混濁，有僅僅可以看出的粒狀物，即25%凝集?！啊币后w均勻混濁。7.平板凝集反應(yīng)與試管凝集反應(yīng)的關(guān)系：用獸醫(yī)生物藥品廠生產(chǎn)的平板抗原作平板凝集試驗(yàn)時(shí)，0.08毫升血清的反應(yīng)相當(dāng)于試管法中1：25血清稀釋液的反應(yīng)，0.04毫升的反應(yīng)相當(dāng)于1：50，0.02毫升的反應(yīng)相當(dāng)于1：100，0.01毫升的反應(yīng)相當(dāng)于1：200。三、結(jié)果判定在我國(guó)，牛、馬和駱駝?dòng)?.02毫升的血清量，豬、山羊、綿羊和狗于0.04毫升的血清量，出現(xiàn)兩個(gè)加號(hào)以上凝集現(xiàn)象時(shí)，被檢血清判為陽(yáng)性反應(yīng)。牛、馬和駱駝?dòng)?.04毫升血清量,豬、山羊、綿羊和狗于0.08毫升的血清量，出現(xiàn)兩個(gè)加號(hào)以上凝集現(xiàn)象時(shí)，被檢

5、血清判為可疑反應(yīng)?？梢煞磻?yīng)的牲畜，經(jīng)3—4周，須重新采血檢驗(yàn)。牛和羊，如果重檢時(shí)仍為可疑，可以判定為陽(yáng)性，豬和馬重檢時(shí)，如果凝集價(jià)仍然保持可疑反應(yīng)水平，而農(nóng)場(chǎng)中的牲畜沒(méi)有布病臨床癥狀和沒(méi)有大批陽(yáng)性反應(yīng)的患畜出現(xiàn)，該畜血清判定為陰性。附：虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）1.虎紅平板試驗(yàn)的特點(diǎn)布魯氏菌虎紅抗原是酸性和具有緩沖作用的染色抗原，虎紅平板試驗(yàn)?zāi)芙衣敦i、牛、羊、鹿布魯氏菌病患病機(jī)體血清中的特異性IgG1亞類抗體。但也有人提出對(duì)IgG2和IgM抗體敏感性較高，椐國(guó)外資料報(bào)導(dǎo)，該試驗(yàn)與常規(guī)試管凝集反應(yīng)試驗(yàn)相比，能較早地檢出患病動(dòng)物，目前為止，國(guó)內(nèi)和國(guó)外的資料證明，虎紅平板試驗(yàn)與補(bǔ)體結(jié)

6、合試驗(yàn)結(jié)果較為接近。該試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，不需要復(fù)雜的設(shè)備，并且能迅速獲得結(jié)果，適用于田間試驗(yàn)和篩選診斷之用?；⒓t平板試驗(yàn)判定方便，具有陽(yáng)性結(jié)果的樣品須進(jìn)一步作補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)或其它輔助試驗(yàn)。這樣做既可節(jié)省勞力又可節(jié)省時(shí)間和得出較為正確的診斷結(jié)果。2.在進(jìn)行虎紅平板試驗(yàn)前，應(yīng)將抗原和受檢血清放置室溫30—60分鐘。準(zhǔn)備一塊潔凈的玻璃板，用蠟筆劃成四平方厘米的方格，每格中滴一份受檢血清0.03毫升。吸取抗原（抗原在吸取前應(yīng)反復(fù)倒轉(zhuǎn)抗原瓶并搖動(dòng)，使抗原均勻懸?。?。在每一方格的血清樣品旁滴0.03毫升，每份血清用一根牙簽攪動(dòng)使血清和抗原均勻混合，使抗原和血清攤開成呈圓形直徑約2—3厘米。于4分鐘

7、內(nèi)判定結(jié)果。出現(xiàn)凝集現(xiàn)象就判為陽(yáng)性反應(yīng)，否則判為陰性。吸取抗原和血清最好采用0.2毫升吸管，或選擇每滴正好0.03毫升的毛細(xì)滴管。如果吸管數(shù)量有限,用過(guò)的吸管應(yīng)至少連續(xù)通過(guò)三個(gè)盛有生理鹽水的杯子沖洗。虎紅抗原應(yīng)置于4—15℃冰箱中或冷暗處保存，不可結(jié)凍，從生產(chǎn)日期起有效期為一年。每次試驗(yàn)均須設(shè)有已知陰、陽(yáng)性血清對(duì)照，只有在對(duì)照血清結(jié)果成立的前提下，受檢血清的檢驗(yàn)方可認(rèn)為是可靠的。?????????????????供稿人：淄博市臨淄區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心