雙抗原夾心elisa方法檢測(cè)艾滋病病毒抗體標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

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1、八五三農(nóng)場(chǎng)職工醫(yī)院檢驗(yàn)科文件編號(hào)：BWS-07-01-001作業(yè)指導(dǎo)書第1頁(yè)共3頁(yè)第3版第0次修訂文件名稱：雙抗原夾心ELISA方法檢測(cè)艾滋病病毒抗體標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程實(shí)施日期：2007-7-11雙抗原夾心ELISA方法檢測(cè)艾滋病病毒抗體標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1、目的規(guī)范抗-HIV抗體檢測(cè)操作程序。2、適用范圍本實(shí)施細(xì)則使用于對(duì)人類血清或血漿中艾滋病毒抗體的初篩檢測(cè)。3、原理采用夾心ELISA方法檢測(cè)血清或血漿樣品中人類免疫缺陷病毒HIV（1+2型）抗體，預(yù)包被高純度重組HIV（1+2型）抗原，待檢血清中的抗HIV抗體與包

2、被抗原反應(yīng)，再與酶標(biāo)HIV-1+2型抗原結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，加底物（TMB）顯色，在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD值，根據(jù)OD值判定有無HIV抗體的存在。4、環(huán)境條件室溫18-25℃。室內(nèi)相對(duì)濕度30-60％5、試劑與材料5.1、吸水紙；5.2、說明書1份；5.3、HIV抗原包被板1塊，每板12條，每條8孔；5.4、HIV酶標(biāo)抗原工作液1瓶；5.5、50倍濃縮洗液1瓶；5.6、HIV陽(yáng)性對(duì)照（已滅活）1支；5.7、HIV陰性對(duì)照1支；5.8、底物液A1瓶；5.9、底物液B1瓶；5.10、終止液1瓶；5.

3、11、封口膠2張；5.12、塑料袋1個(gè)；5.13、（新鮮）蒸餾水或去離子水；5.14、一次性V型水槽；5.15、一次性瓶（塑料），用于準(zhǔn)備TMB底物液；5.16、一次性乳膠手套；5.17、記時(shí)器；5.18、5％次氯酸鈉或其他認(rèn)可消毒液；5.19、適用盛裝有可能受污染的物品的容器；5.20、尿過氧化物溶液2瓶，每瓶11ml。6、儀器6.1、酶標(biāo)儀；6.2、水浴箱（35-39℃）；6.3、離心機(jī)；6.4、洗板機(jī)；八五三農(nóng)場(chǎng)職工醫(yī)院檢驗(yàn)科文件編號(hào)：BWS作業(yè)指導(dǎo)書第2頁(yè)共3頁(yè)第3版第0次修訂文件名稱：雙抗原夾心E

4、LISA方法檢測(cè)艾滋病病毒抗體標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程實(shí)施日期：2007-7-116.5、打印機(jī)。7、操作步驟7.1、使用前將試劑盒從冰箱中取出平衡至室溫，取出所須板條，剩余的及時(shí)封存放回冰箱。7.2、每次實(shí)驗(yàn)均須設(shè)立空白對(duì)照孔2孔，不加樣品和酶結(jié)合物，只加底物和終止液；抗-HIV陽(yáng)性對(duì)照孔3孔，每孔50或100μl。7.3、其余各孔加待檢測(cè)標(biāo)本50或100μl。7.4、覆蓋粘膠紙，置37℃孵育30或60分鐘。7.5、將50倍濃縮洗液用純化水50倍稀釋后備用。7.6、取出已孵育完畢的反應(yīng)板，棄去粘膠紙，放入洗板機(jī)中，吸

5、干板內(nèi)液體，將洗滌液注滿酶孔（約300μl/孔），吸干，反復(fù)5次，在干凈紗布上將板拍干。7.7、除空白孔外，每空加入酶標(biāo)抗原工作液50或100μl，貼上封口膠。37℃溫育20或30分鐘。7.8、洗滌同步驟7.6。7.9、每孔加入底物緩沖液A50μl、TMBB50μl，混勻，置37℃顯色10分鐘。7.10、加終止液50μl振蕩反應(yīng)板5秒種，使之充分混勻。7.11、在酶標(biāo)讀數(shù)儀中，取波長(zhǎng)450nm（建議使用雙波長(zhǎng)酶標(biāo)儀比色，參考波長(zhǎng)630nm），以空白對(duì)照孔校零，讀取每孔吸收值（加終止液后，務(wù)必在15分鐘內(nèi)讀數(shù)

6、完畢）。8、質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)8.1、抗HIV陽(yáng)性對(duì)照OD值＞0.8，抗HIV陰性對(duì)照OD值＜0.08或0.12。8.2、陽(yáng)性對(duì)照OD值有效范圍：≥0.50。8.3、陰性對(duì)照OD值有效范圍：≤0.10。8.4、陰、陽(yáng)性對(duì)照和被檢樣本的OD值減去空白對(duì)照OD值即為計(jì)算值。8.5、臨界值（CUTOFF）=0.10或0.15+陰性對(duì)照OD均值。8.6、樣品OD值≥臨界值者為HIV抗體陽(yáng)性，初試陽(yáng)性應(yīng)重新取樣雙孔復(fù)試，復(fù)試陽(yáng)性者應(yīng)按照“全國(guó)HIV檢測(cè)管理規(guī)范”送“HIV確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室”進(jìn)行確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。8.7、樣品OD值≤臨界

7、值者為HIV抗體反應(yīng)陰性。8.8、陰性對(duì)照值若小于0.02，以0.02計(jì)算。8.9、被檢樣本的OD值≥臨界值判為HIV抗體陽(yáng)性。8.10、每次實(shí)驗(yàn)必須做外部質(zhì)控。8.11、質(zhì)控血清有明確的標(biāo)記，保存-20℃以下。9、說明9.1、本試劑的使用單位必須是經(jīng)當(dāng)?shù)匦l(wèi)生部門批準(zhǔn)的HIV初篩實(shí)驗(yàn)室。9.2、整個(gè)檢測(cè)工作必須符合HIV實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范和生物安全守則規(guī)定，嚴(yán)格防止交叉感染。9.3、標(biāo)本和酶結(jié)合物均應(yīng)加樣器加注，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性。9.4、所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。9.5、洗滌液若出現(xiàn)結(jié)晶，

8、可置37℃溶解。9.6、粘膠紙不能反復(fù)使用。9.7、微孔條從冷藏環(huán)境中取出時(shí)，應(yīng)在室溫平衡至無潮氣方可使用，未用完的須放入有干燥劑的密封袋中保存。八五三農(nóng)場(chǎng)職工醫(yī)院檢驗(yàn)科文件編號(hào)：BWS作業(yè)指導(dǎo)書第3頁(yè)共3頁(yè)第3版第0次修訂文件名稱：雙抗原夾心ELISA方法檢測(cè)艾滋病病毒抗體標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程實(shí)施日期：2007-7-119.8、洗滌時(shí)各孔須加滿液體，防止孔口有游離酶不能洗凈。使用洗板機(jī)洗滌應(yīng)設(shè)定30-60秒浸泡時(shí)間。9