survivin反義寡核苷酸誘導(dǎo)白血病細胞凋亡的研究

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1、survivin反義寡核苷酸誘導(dǎo)白血病細胞凋亡的研究TheeffectofsurvivinantisenseoligonucleotideonapoptosisofHL-60cells前言1997年耶魯大學(xué)的Altieri博士用EPR-1的cDNA在人類基因組庫的雜交篩選實驗中發(fā)現(xiàn)了一段15kb大小的基因片段，它編碼了142個氨基酸組成的Survivin蛋白；Survivin的編碼基因位于染色體17q25，是凋亡抑制蛋白（IAP）家族的新成員StructureofhumanIAPproteinfamily17q25BIR:bac

2、uloviralIAPrepeatRZF:ringzinc-fingleCARD:caspaserecruitmentdomainInhibitorofApoptosisLocationinhumanchromosomeSurvivin分子結(jié)構(gòu)長α螺旋BIR區(qū)Survivin分子結(jié)構(gòu)長α螺旋BIR區(qū)Survivin分子結(jié)構(gòu)Survivin形成二聚體Survivin表達肺癌肝癌膀胱癌皮膚癌神經(jīng)母細胞瘤乳腺癌食管癌胃癌白血病Survivin表達SURVIVIN選擇性表達于絕大多數(shù)腫瘤組織在正常成人分化組織中不表達（包括癌旁組織）普遍

3、性獨特性Survivin作用!Survivin作用Survivin抗凋亡腫瘤細胞分裂增加凋亡減少研究內(nèi)容反義Survivinsurvivin表達受抑活化細胞凋亡技術(shù)路線HL-60細胞體外懸浮培養(yǎng)摻入反義寡核苷酸48h后分別于24h、48h形態(tài)學(xué)觀察、死活細胞計數(shù)收獲細胞、檢測指標RT-PCRTUNELFCM材料細胞株HL-60細胞株（急性早幼粒細胞系）由中國科學(xué)院上海細胞所提供RNAgentsTotalRNAIsolationSystemPromega公司AccessQuickTMRT-PCRSystemPromega公司Pro

4、pidumIodide(PI,碘化丙啶)Sigma公司主要藥品與試劑材料研究方法反義寡核苷酸的序列survivin反義硫代寡聚脫氧核苷酸(Aspo)序列5’GGCAACGTCGGGGCACCCAT3’[9]非特異性對照硫代寡聚脫氧核苷酸(Nspo)序列5’GCCATCGTAGGGGATCGCTT3’[9]上海SANGON公司合成與純化培養(yǎng)箱20%新生小牛血清RPMI-1640液100U/ml青霉素100ug/ml鏈霉素37oC5%CO2飽和濕度倒置顯微鏡觀察2~3天傳代一次細胞系的培養(yǎng)和傳代HL-60細胞Photo1.HL-60

5、cells（×100）Tab1.TheexperimentgroupinggroupfactorconcentrationControlRPMI-1640mixtureNspoNspo15.0umol/LAspo5.0Aspo5.0umol/LAspo10.0Aspo10.0umol/LAspo15.0Aspo15.0umol/L實驗分組及寡核苷酸的摻入1000r/min離心5minRPMI-1640洗1次細胞起始濃度4×106/ml取細胞懸液1000ul接種至24孔板核酸100ul置CO2培養(yǎng)箱中孵育HL-60細胞細胞增殖能力

6、及活力觀察HL-60細胞于24、48h取50ul細胞懸液0.4%臺盼藍染色計數(shù)死活細胞著色為死細胞拒染為活細胞計算細胞存活率細胞增殖能力及活力觀察HL-60細胞survivinmRNA的表達總RNA的提取細胞沉淀加入300ulD液加入30ulSodiumAcetate加入苯酚:氯仿:異戊醇300ul冰浴15min10000g4℃離心20min轉(zhuǎn)移上清加入等量異丙醇20℃放置10min10000g4℃離心10min75%冷乙醇洗滌RNA10000g4℃離心10min以無RNase的純水溶解沉淀RNA純度檢驗和定量RNAHL-60細

7、胞survivinmRNA的表達RT-PCR反應(yīng)體系50μl48℃延伸45min95℃預(yù)變性2minPCR循環(huán)95℃45sec61℃1min72℃1min共30個循環(huán)72℃延伸5min模板RNA1ulAMV逆轉(zhuǎn)錄酶1ul上游引物3ul下游引物3ulAccessQuickTMMasterMix25ulTdt酶介導(dǎo)的缺口末端標記法具體操作按試劑盒說明書進行結(jié)果與判定：細胞核為棕褐色者為陽性細胞，即凋亡細胞凋亡細胞指數(shù)=凋亡細胞數(shù)細胞總數(shù)×100%DNA倍體分析及凋亡率的檢測實驗流程單細胞懸液不含Ca2+或Mg2+的PBS洗細胞2次1

8、000g離心5min棄上清計數(shù)細胞總數(shù)500μlPBS重懸5ml冷乙醇4℃過夜離心洗細胞2次含1%小牛血清的800μlPBS重懸避光孵育1h100μl煮沸過的RNA酶A37℃30分鐘FCM分析加入100μlPI統(tǒng)計分析結(jié)果均以“均數(shù)±標準差”表示，組間比較用單因