土壤淀粉酶產(chǎn)生菌的分離純化及相關性質測定

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1、土壤淀粉酶產(chǎn)生菌的分離純化及相關性質測定摘要：為了了解土壤中微生物的種類和特征并從中分離出淀粉酶產(chǎn)生菌，對其進行純化和培養(yǎng)，并測定其產(chǎn)生的淀粉酶的活性以及對其進行生理生化試驗，了解其代謝特征，需要進行一系列的實驗，并在此過程中掌握分離純化微生物、微生物液體培養(yǎng)法、透明圈法測定淀粉酶活力以及生理生化試驗的操作方法和原理。主要實驗過程如下：從土壤中篩選淀粉酶產(chǎn)生菌后進行復篩，接著進行種子培養(yǎng)，所得發(fā)酵液用于淀粉酶活力的測定以及生理生化反應。關鍵詞：土壤淀粉酶產(chǎn)生菌分離純化發(fā)酵培養(yǎng)透明圈法生理生化試驗正文：1、土壤淀粉酶產(chǎn)生菌的分離與純化1.1實驗原理在自然條件下，微

2、生物常常在各種生態(tài)系統(tǒng)中群居雜聚。為了研究某種微生物的特性，或者大量培養(yǎng)和利用某一種微生物，必須事先從有關的生態(tài)環(huán)境中分離出所需的菌株，獲得純培養(yǎng)。獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的純種分離法，也即是從含有多種雜居在一起的微生物材料中，通過稀釋分離、劃線分離、單孢子分離等方法，使它們分離成為單個個體并在固定培養(yǎng)基的固定地方繁殖成為單個菌落，從單個菌落中挑選所需純種。不同微生物可用不同培養(yǎng)基和不同培養(yǎng)條件進行單菌分離獲得純種，純種再經(jīng)繁殖培養(yǎng)后，可用于進一步研究形態(tài)、生理等欲從含有多種微生物的樣品中直接辨認出，并且取得某種所需微生物的個體進行純培養(yǎng)，那是困難的。由于微生

3、物可以形成菌落，而每個單一菌落常常是由一種個體繁殖而成。不同微生物的菌落是可以識別和加以鑒定的。因此將樣品中不同微生物個體在特定的培養(yǎng)基上培養(yǎng)出不同的單一菌落，再從選定的某一所需菌落中取樣，移植到新的培養(yǎng)基中去，就可以達到分離純種的目的。這就是純種分離法的原理。在微生物的分離和純種培養(yǎng)過程中，必須使用無菌操作技術。所謂無菌操作，就是在分離、接種、移植等各個操作環(huán)節(jié)中，必須保證在操作過程中杜絕外界環(huán)境中的雜菌進入培養(yǎng)的容器。淀粉是有葡萄糖通過α-1,4糖苷鍵構成的直鏈淀粉和α-1,6位有分支的直鏈淀粉組成的。按照水解方式的不同，主要的淀粉酶可以分為α-淀粉酶、β-

4、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和異淀粉酶4大類。產(chǎn)淀粉酶的微生物有細菌、霉菌和酵母等。利用淀粉遇碘變?yōu)樗{色的特性，將分離的微生物接種在含有淀粉的固體培養(yǎng)基表面進行培養(yǎng)，利用滴加碘液后菌落周圍出現(xiàn)透明圈，未水解的淀粉呈藍色，水解圈無色，判斷是否產(chǎn)生淀粉酶及初步判斷淀粉酶活力的高低。從微生物群體中經(jīng)分離、生長，在平板上形成的肉眼可見的菌落，不一定是單個細胞生長繁殖而成的，有的可能來自2個或者多個細胞。因此，純培養(yǎng)的確定觀察菌落特征外，還要結合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征等綜合考慮。甚至有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過一系列的分離與純化過程和多種特征鑒定方能得到。1.2實驗器材1.2.1材料

5、土壤樣品、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、99ml無菌水1瓶（帶玻璃珠）、5支9ml無菌水/試管等。1.2.2用具無菌培養(yǎng)基、無菌吸管、無菌水、酒精燈、無菌涂布棒（又名擴散棒、三角棒）、接種環(huán)、生物潔凈工作臺、生化培養(yǎng)箱、人工智能培養(yǎng)箱、手動菌落計數(shù)器（SC6）、移液器、移液槍、試管、三角瓶、顯微鏡等。1.3實驗過程1.3.1土壤稀釋液的制備稱取土壤，制備稀釋度分別為10-3、10-4、10-5、10-6、10-7土壤稀釋液。1.3.2稀釋平板法從土樣中分離真菌先在無菌培養(yǎng)皿中加入稀釋度為10-7的土壤稀釋液0.2mL，再加入馬鈴薯培養(yǎng)基，充分混勻

6、鋪平并凝固后倒置于28~30℃恒溫培養(yǎng)5~6d，培養(yǎng)完成后觀察真菌菌落形態(tài)。結果如圖1所示，培養(yǎng)基上分布有多個菌落，根據(jù)顏色判斷為有兩種真菌，一種正面為青色，背面為肉色，有9個菌落，另一種正面為墨綠色，背面為黑色，有霉味，有3個菌落。圖1稀釋平板法分離真菌結果1.3.3平板涂抹法分離土壤中的放線菌先在無菌培養(yǎng)皿中倒入適量淀粉培養(yǎng)基，鋪成平板，凝固后，再加入稀釋度為10-7的土壤稀釋液0.2mL，用無菌三角玻棒在平板表面涂抹均勻，倒置于28~30℃條件下培養(yǎng)3~4d，觀察放線菌菌落形態(tài)。結果如圖2所示，并沒有分離得到單菌落，而只有菌苔，顏色為黃色，有泥腥味。沒有出

7、現(xiàn)單菌落可能是操作出現(xiàn)差錯，因為稀釋度為10-7，并沒有偏大，所以可能是操作的問題。圖2平板涂抹法分離放線菌結果1.3.4平板劃線法分離土壤中的細菌先在無菌培養(yǎng)皿中倒入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，制成平板，再用分區(qū)劃線法挑取稀釋度為10-2的土壤稀釋液一環(huán)在平板上劃線。劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置于28~30℃培養(yǎng)。觀察細菌菌落形態(tài)，結果如圖3所示，有肉眼可見的單菌落，直徑約為3mm，顏色為肉色，有臭味。圖3平板劃線法分離細菌結果1.3.5用劃線分離法對淀粉酶產(chǎn)生菌進行分離純化1.3.5.1在分離出真菌的馬鈴薯培養(yǎng)基的平板上滴加碘液，如圖4所示，可以看出僅有一個菌落的水解圈

8、較大符合要求，挑取該菌落