實(shí)驗(yàn)一土壤中淀粉酶產(chǎn)生菌的分離和純化.doc

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1、實(shí)驗(yàn)一土壤中淀粉酶產(chǎn)生菌的分離和純化一、目的和要求1.掌握常用培養(yǎng)基的配制方法。2.掌握微生物的分離、純化及菌種保藏的基本原理和方法。3.練習(xí)微生物接種、移植和培養(yǎng)等基本技術(shù)，掌握無菌操作技術(shù)。二、基本原理在土壤、水、空氣或人及動(dòng)、植物體中，混雜生存著大量不同種類的微生物，從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求,或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合

2、平板法或平板劃線分離法等方法分離、純化出該微生物，直至得到純菌株。需要注意的是，從微生物群體中經(jīng)分離生長在平板上的單個(gè)菌落并不能保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測個(gè)體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)需要經(jīng)過一系列分離與純化過程和多種特征鑒定才能得到。土壤是微生物生活的大本營，這里生活的微生物在數(shù)量和種類上都是極其多樣的，因此，土壤中的微生物具有較高的豐富度和多樣性，土壤是我們開發(fā)利用微生物資源的重要基地，可以從其中分離、純化到許多有用的菌株。本實(shí)驗(yàn)將采用平板分離法從土壤中分離出淀粉酶高產(chǎn)的菌。三、試驗(yàn)材料1.樣品：草坪采集的新鮮土壤2.培養(yǎng)基2.

3、1平板篩選培養(yǎng)基牛肉膏5g蛋白胨10gNaCl5g可溶性淀粉2g蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)PH為7.0，121℃滅菌20min（固體培養(yǎng)基，則每升培養(yǎng)基中加20g瓊脂）。2.2斜面培養(yǎng)基牛肉膏5g蛋白胨10gNaCl5g可溶性淀粉2g蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)PH為7.0，121℃滅菌20min（固體培養(yǎng)基，則每升培養(yǎng)基中加20g瓊脂）。3.溶液和試劑新鮮土壤、蒸餾水、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂、可溶性淀粉、稀碘液、NaCl、1M/LNaOH溶液、1M/LHCl溶液4.儀器或其它用具無菌培養(yǎng)皿、無菌吸管、無菌三角玻棒、微量移液器、移液器槍頭、恒溫培養(yǎng)箱、無菌工作臺、天平、吸耳球、pH計(jì)、量筒、試管

4、、三角瓶、玻璃珠、漏斗、分裝架、玻璃棒、燒杯、鐵絲筐、接種環(huán)、酒精燈、牛皮紙、紗布、鐵架臺、電爐、滅菌鍋、干燥箱、水浴鍋、冰箱等四、試驗(yàn)路線稱取土樣→梯度稀釋→平板篩選→斜面接種→平板劃線分離純化五、操作步驟1培養(yǎng)基的制備1.1稱量按培養(yǎng)基配方依次準(zhǔn)確稱取各藥品，放入適當(dāng)大小的燒杯中，蛋白胨極易吸潮，稱量應(yīng)迅速；牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿稱量，用熱水溶化后倒入燒杯，也可放稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時(shí)如稍微加熱，牛肉膏便會與稱量紙分離，然后立即取出紙片。1.2溶化在燒杯中先加入4/5總體積蒸餾水。將藥品完成溶解后，倒入鍋中加熱至煮沸時(shí)加入瓊脂，邊夾邊攪拌直到瓊脂完全溶解。

5、1.3調(diào)Ph根據(jù)培養(yǎng)基對pH的要求，用1M/LNaOH或1M/LHC1溶液調(diào)至所需pH。測定pH可用pH試紙或酸度計(jì)等,最后補(bǔ)充水到所需總體積。1.4分裝過濾后立即用漏斗進(jìn)行分裝。分裝時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾染在管口或瓶口，以免浸濕棉塞，引起污染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜，固體分裝量為管高的1/5，滅菌后制斜面；分裝三角瓶，其裝量以不超過三角瓶容積的一半為宜。1.5加塞培養(yǎng)基分裝完畢，在試管口或三角燒瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能。1.6滅菌將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜，放回內(nèi)層鍋，并裝入培養(yǎng)基，

6、加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)，加熱，0.103MPa，121℃并同時(shí)打開排氣，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣，待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸氣壓力增加而逐漸上升；當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，控制電壓以維持恒溫，并開始計(jì)算滅菌時(shí)間。30min后，切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至”0”時(shí)，打開排氣，旋送螺銓，打開蓋子，取出。1.7擱置斜面將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50℃左右，將試管口端擱置在玻棒或其它合適高度的器具上，斜面長度以不超過試管總長的一半為宜。1.8倒平板將滅菌后的培養(yǎng)基，于水浴鍋中冷卻到55～60℃，立刻倒平板，倒平板的方法是右手持盛培養(yǎng)

7、基的試管或三角燒瓶，置火焰旁邊，左手拿平皿并松動(dòng)試管塞或瓶塞，用手掌邊緣和小指、無名指夾住拔出，如果試管內(nèi)或三角燒瓶內(nèi)的培養(yǎng)基一次可用完，則管塞或瓶塞不必夾在手指中。試管（瓶）口在火焰上滅菌，然后左手將培養(yǎng)皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。也可將平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夾住管塞并打開培養(yǎng)皿，再注入培養(yǎng)基，搖勻后制成平板。2淀粉酶