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1、土壤中放線菌的分離和純化實驗一、實驗目的1、制作MS培養(yǎng)基的方法，掌握母液的保存方法。2、掌握培養(yǎng)基的滅菌方法。掌握外植體的消毒和超凈工作臺的使用。4、掌握放線菌的分離純化及染色的基本流程；5、掌握高氏一號培養(yǎng)基的配制方法；6、復習分離純化放線菌的基本操作技術(shù)、培養(yǎng)方學會使用高壓蒸汽滅菌鍋。7、培養(yǎng)微生物實驗的設(shè)計思路和動手能力。二、實驗材料高壓蒸汽鍋、培養(yǎng)瓶、石斛的愈傷組織、超凈工作臺，酒精燈、灑精棉球、鑷子、電子天平、稱景紙、燒杯、景筒、顯微鏡、三角錐形瓶、無菌培養(yǎng)皿、接種環(huán)、酒精燈、分析天平；接
2、種環(huán)、載玻片、蓋玻片、玻璃珠、移液槍、剪刀三、實驗原理植物組織培養(yǎng)即植物無菌培養(yǎng)技術(shù)，又稱離體培養(yǎng)，是根據(jù)植物細胞具右全能性的理論，利用植物體離體的器官（如根、莖、葉、莖尖、花、果實等）、組織（如形成層、表皮、皮層、髓部細胞、胚乳等）或細胞（如大孢子、小孢子、體細胞等）以及原生質(zhì)體，在無菌和適宜的人工培養(yǎng)基及溫度等人工條件下，能誘導出愈傷組織、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的學科。U!1、配制MS培養(yǎng)基8L，稱取馬鈴薯1600g、香蕉400g、蔗糖240g、活性炭8半勺、瓊脂80g、配制母液。2、
3、配制培養(yǎng)液時應注意：①在使用提前配制的母液時，應在量取各種母液之前，輕輕搖動盛放母液的瓶子，如果發(fā)現(xiàn)瓶中有沉淀、懸浮物或被微生物污染，應立即淘汰這種母液，重新進行配制；為防止母液被微生物污染，有機母液放在冰箱里4°C保存；②用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量簡或移液管潤洗2次；③量取母液時，最好將各種母液按將要量取的順序?qū)懺诩埳?，量?種，劃掉1種，以免出錯。溶化瓊脂用粗天平分別稱取瓊脂9g、蔗糖30g，放入1000mL的搪瓷量杯中，再加入蒸餾水750mL，用電爐加熱，邊加熱邊用
4、玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀。然后再將配好的混合培養(yǎng)液加入到煮沸的瓊脂中，最后加蒸餾水定容至1000mL,攪拌均勻。需要注意的是，在加熱瓊脂，制備培養(yǎng)基的過程中，操作者千萬不能離開，否則沸騰的瓊脂外溢，就需要秉新稱量、制備。此外，如果沒有搪瓷量杯，可用大燒杯代替。但要注意大燒杯底的外表面不能沾水，否則加熱時燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。調(diào)pH用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時用pH試紙測培養(yǎng)基的pH，一直調(diào)到培養(yǎng)基的pH為6（5.8?
5、6.5）左右為止。培養(yǎng)基的分裝溶化的培養(yǎng)基應該趁熱分裝。分裝時，先將培養(yǎng)基倒入燒杯中，然后將燒杯中的培養(yǎng)基倒入錐形瓶（50mL或100mL）中。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶U和瓶壁上。錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的1/5?1/4。每1000mL培養(yǎng)基，可分裝25?30瓶。培養(yǎng)基分裝完畢后，應及時封蓋瓶口。用2塊硫酸紙（每塊大小約為9cmX9cm）中間夾1層薄牛皮紙封蓋瓶口，并用線繩捆扎。最后在錐形瓶外壁貼上標簽。3、高壓滅菌培養(yǎng)基的高壓滅菌包括以下兒個步驟。第一，碼放錐形瓶。將裝有培養(yǎng)基的錐形瓶直立于金
6、屬小筐中，再放入高壓蒸氣滅菌鍋內(nèi)。如果沒有金屬小筐，可以在兩層錐形瓶之間放一塊玻璃板隔開。第二，放置其他需要滅菌的物品。將其他需要滅菌的物品也放入高壓蒸氣滅菌鍋內(nèi)，如裝存蒸餾水的錐形瓶、帶螺U蓋的玻璃瓶、燒杯、廣口瓶（以上物品都要用牛皮紙封口），用報紙包裹的培養(yǎng)皿、剪刀、解剖刀、鑷子、濾紙、鉛筆等。第三，滅菌。待需要滅菌的物招碼放完平?，蓋上鍋蓋。在98kPa、121°C下，滅菌20min。滅菌后取出錐形瓶，讓其中的培養(yǎng)基自然冷卻凝固后再使用4，、再在操凈工上進行消毒，先用紫外線照射30MIN，然后送
7、風，關(guān)閉紫外燈，改用口光燈，對手用酒精進行消毒，對培養(yǎng)基表面也要用酒精進行消毒。準備工作好了，就進行接種。并且要在酒精燈旁邊進行操作，避免污染。鑷子要在雙孔滅菌器上進行滅菌。4、接種完成后要整理工作臺，并且把培養(yǎng)瓶拿到培養(yǎng)架上進行曰光培養(yǎng)。五、放線菌的提取步驟5、（1）稱取土樣2.00g，在火焰旁加到一個盛有48ml無菌水并裝有玻璃珠的100ml錐形瓶中。振蕩20-30min，使樣品的菌體、芽孢或孢子均勻分散。靜止20-30s，標記為編號1。6、（2）按照一定的梯度進行稀釋（該實驗采用10倍梯度）①取
8、3個各裝有9.5ml無菌水的25ml錐形瓶，分別按照順序標記好2、3、4.②在超凈工作臺上，用微量移液器從1號錐形瓶中移取0.5ml土壤懸液加到2號錐形瓶中，搖勻后，再用微量移液器從2號錐形瓶中移取0.5ml土壤懸液加到3號錐形瓶中，依此類推，7、分別將土壤懸液制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10的土壤稀釋液。六、稀釋涂布法分離土壤中放線8、（1）倒平板9、將配制好并且滅菌的高氏一號培養(yǎng)
