產(chǎn)甲烷菌的分離、培養(yǎng)及鑒定方法

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1、產(chǎn)甲烷菌是一類以產(chǎn)生大量甲烷氣體作為能量代謝的終產(chǎn)物的特殊原核微生物，廣泛存在于各種極端厭氧環(huán)境中。作為自然界碳素循環(huán)中厭氧生物處理的最后一個成員，該菌與其它菌群協(xié)同作用，將大量的有機物轉(zhuǎn)化成可再生能源，對自然界中的物質(zhì)循環(huán)及當今社會能源危機中的能源替代問題具有極大的推動作用。通過本實驗，我們可掌握產(chǎn)甲烷菌等厭氧菌的分離、培養(yǎng)及活菌計數(shù)的一般方法，能夠?qū)崟r觀察產(chǎn)甲烷菌的形態(tài)特征并了解產(chǎn)甲烷菌的生長特性。摘要產(chǎn)甲烷菌是一類以產(chǎn)生大量甲烷氣體作為能量代謝的終產(chǎn)物的特殊原核微生物，廣泛存在于各種極端厭氧環(huán)境中。作為自然界碳素循環(huán)中厭氧生物處理的最后一個成員，該菌與其它菌群協(xié)同作用，將大量的有

2、機物轉(zhuǎn)化成可再生能源，對自然界中的物質(zhì)循環(huán)及當今社會能源危機中的能源替代問題具有極大的推動作用。通過本實驗，我們可掌握產(chǎn)甲烷菌等厭氧菌的分離、培養(yǎng)及活菌計數(shù)的一般方法，能夠?qū)崟r觀察產(chǎn)甲烷菌的形態(tài)特征并了解產(chǎn)甲烷菌的生長特性。一、實驗原理(一)產(chǎn)甲烷菌厭氧微生物在自然界分布廣泛，種類繁多，其生理作用日益受到人們的重視。產(chǎn)甲烷菌是專性厭氧菌，對氧氣非常敏感，因此，產(chǎn)甲烷菌的分離、培養(yǎng)及活菌計數(shù)的關鍵是提供無氧和低氧化還原電勢的培養(yǎng)環(huán)境。(二)產(chǎn)甲烷菌的發(fā)現(xiàn)歷史自1901—1903年巴斯德研究所的馬載（Maze）第一次觀察到一種產(chǎn)甲烷菌的微球菌（馬氏甲烷球菌）以來，迄今共發(fā)現(xiàn)了五十多種產(chǎn)甲烷

3、菌。1974年Bryant提出產(chǎn)甲烷菌這一名詞，為避免這一類細菌與氧化甲烷的好氧菌相混淆。1979年由BalchW.E.等人根據(jù)菌株間16SrRNA降解后各寡核苷酸中堿基排列順序間相似性的大小，提出了一個新的系統(tǒng)分類方法，共分為3個目、4個科、7個屬、13個種。(三)定義、性質(zhì)及分布產(chǎn)甲烷菌（Mathanogens）是一類必須生活在厭氧生境下并伴有甲烷產(chǎn)生的古生菌，其形態(tài)和生理、生化特性呈現(xiàn)明顯的多樣性。它生長的氧化還原電位約為-0.33V，最適生長溫度為35—40度，最適pH為6.0-7.2。例如細胞形態(tài)有球狀、短桿狀、長桿狀、螺旋狀和絲狀等；Gram染色反應有陽性、陰性和不定性；生

4、長所需碳源約有10多種，除CO2外，還有其它一碳化合物（甲酸、甲醇、甲胺等）和二碳化合物（乙酸等）；只有當產(chǎn)甲烷菌在利用H2作CO2還原劑以產(chǎn)生生物合成所需細胞物質(zhì)，才能利用CO2作電子受體以產(chǎn)生ATP和CH4。產(chǎn)甲烷菌廣泛分布于自然界，在淤泥、瘤胃、人和動物的腸道、昆蟲的腸道、濕樹木、地熱泉水、深?；鹕娇凇⑺锖秃Ｑ蟮某练e物、沼澤等厭氧環(huán)境中都有產(chǎn)甲烷菌存在。(四)產(chǎn)甲烷菌的培養(yǎng)在培養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌時，最需要控制的是厭氧條件，在pH=7.0，O2的濃度與1atm的氧平衡時，O2——O2-反應的電位是0.81V，因此，在-0.33V時，O2濃度是大氣壓中O2濃度的10-75。每升飽和了空氣的

5、水中含有1.48×10-55個O2。所以說，要保證產(chǎn)甲烷菌培養(yǎng)時的低電位是很重要的。產(chǎn)甲烷菌的培養(yǎng)方法很多，如厭氧箱法、厭氧袋法、厭氧罐法。這些方法都需要特定的除氧措施，操作步驟多，較繁瑣。本實驗介紹的是一種簡便的試管培養(yǎng)法——亨蓋特厭氧滾管技術，亨蓋特厭氧滾管技術是美國微生物學家亨蓋特于1950年首次提出并應用于瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養(yǎng)技術因此他是世界上第一個分離純化產(chǎn)甲烷菌的人。以后這項技術又經(jīng)歷了幾十年的不斷改進，從而使亨蓋特厭氧技術日趨完善，并逐漸發(fā)展成為研究厭氧微生物的一套完整技術，而且多年來的實踐已經(jīng)證明它是研究嚴格、專性厭氧菌的一種極為有效的技術。該技術的優(yōu)點是：

6、預還原培養(yǎng)基制好后，可隨時取用進行試驗；任何時間觀察或檢查試管內(nèi)的菌種都不會干擾厭氧條件。二、材料、試劑及設備(一)材料已分離純化的產(chǎn)甲烷菌（Mathanogens）(二)設備生物科研網(wǎng)www.biom.cn提醒：高純氮氣，厭氧管，厭氧手套箱，注射器，恒溫培養(yǎng)箱，銅柱除氧系統(tǒng)，定量加樣器，厭氧罐，超聲波破碎儀，酒精燈，冰塊，水浴鍋，記號筆，振蕩器。(三)試劑1.改良的PRAS無氮培養(yǎng)基，其配方組成為：NH4CL1g，MgCl20.1g，K2HPO40.4g，KH2PO40.2g，甲酸鈉5g，乙酸鈉5g，甲醇3.5ml，Ph值為7.0，蒸餾水1000ml，1%的樹脂刃天青（還原指示劑）1

7、ml，121攝氏度滅菌20min。使用前每5ml培養(yǎng)基加入1%Na2S（還原劑）和5%NaHCO3及3000u/ml青霉素液（抑制劑）各0.1ml；2.糖發(fā)酵培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基（液體）；3.冰塊Na2SNaHCO3；4.乙醚，吲哚試劑，盧戈氏碘液。三、實驗步驟(一)分離與培養(yǎng)1.銅柱系統(tǒng)除氧銅柱是一個內(nèi)部裝有銅絲或銅屑的硬質(zhì)玻璃管。此管的大小為40～400mm，兩端被加工成漏斗狀，外壁繞有加熱帶，并與變壓器相連來控制電壓和穩(wěn)定銅