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《高效快速篩選新發(fā)現的微衛(wèi)星位點的方法-hrm》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在教育資源-天天文庫。
1、高效快速篩選新發(fā)現的微衛(wèi)星位點的方法-HRM摘要：本文介紹了一種新的識別微衛(wèi)星位點的方法，微衛(wèi)星標記是一種功能強大的共顯性標記，擴增產物可靠且可以確定已知物種的高度的多態(tài)信息含量，但是對于新位點的發(fā)現依然是一種費時費力的方法。相對于大腸桿菌文庫分離方法，新一代測序技術（NGS）可以得到更多可用的候選基因。我們對已知微衛(wèi)星引物的注釋作了系統的論述，并發(fā)現無論采用什么分離技術，由于PCR未充分擴增，基因位點的單態(tài)性或多拷貝都會導致一半以上的候選基因丟失。因此，在分子標記技術上，篩選候選基因依然是一個很關鍵的步驟。我們通過重新評估毛細電泳法進行基因分型，發(fā)現HRM可以用于基因分型及篩選候
2、選基因，對此列出了具體的流程。通過該流程，或許我們可以快速地進行新一代標記的檢測，并可以把費用降低到傳統方法的一半甚至四分之一。關鍵詞：HRM微衛(wèi)星重新分離技術分子標記新一代測序技術群體遺傳學引言微衛(wèi)星也叫簡單重復序列（SSRs），是群體遺傳學中最強大的共顯性標記，具有廣泛的應用(e.g.,ChambersandMacAvoy2000;Ellegren2004;JarneandLagoda1996;MacDonaldetal.2011)。最近由于新一代測序技術（NGS）的發(fā)展正解決SSRs技術中的一個重要的缺陷，不能獲得足夠的設計引物的數據。擴增片段多態(tài)位點的選擇，依然是一件費時費
3、力的工作，這是SSRs發(fā)展中的另一個瓶頸。因此我們引進了HRM用于識別潛在的SSR位點，并且HRM有望加快SSR的發(fā)展速度，降低傳統方法的費用。SSRs一般是以核心序列1-6bp為重復單位首尾串聯而成的短的DNA序列(Wanetal.2004)。微衛(wèi)星具有高突變率、易于進行PCR擴增、便于毛細電泳法(CE)的分析以及可以利用許多軟件工具進行生物學推論的諸多優(yōu)點，使其在群體遺傳學方面得到廣泛應用。傳統的SSR位點的重新分離，是借助于豐富的基因文庫(GlennandSchable2005;Zaneetal.2002)，但是該法對于SSR位點不多的物種則不能檢測到足夠的位點進行分析(Ar
4、thoferetal.2007;Megle′czetal.2004)。由于NGS的不斷改進，尤其是羅氏454FLX鈦化學（TitaniumXL?試劑盒可以使其被更廣泛的應用）能夠識別更多的片段，NGS如今已逐漸取代克隆文庫(Castoeetal.2010;Santanaetal.2009;Vanpe′etal.2009)。最重要的一點是NGS建立了無可比擬的信息含量，而在大部分文獻中大腸桿菌文庫的克隆序列卻低于1000個（參考本文文獻評論），NGS可以產生成千上萬的序列，其中SSR位點達好幾千。這些重復區(qū)域可以用來設計引物，也可以用軟件包進行分析了(Kofleretal.2007;
5、Megle′czetal.2009)。借助于傳統的和是基于NGS的分離技術，就可以對擴增的新位點、基因組中單拷貝位點及豐富的多態(tài)性進行檢測。篩選步驟通常包括個體序列的擴增，確定擴增片段質量的凝膠電泳和評定等位基因多樣性的毛細管電泳。高分辨率熔解曲線分析技術（H(Graham2005;Wittweretal.2003;Zhouetal.2004,2005)RM）是一種用于PCR產物分析的均一性好，真正的閉管操作技術。首先是添加熒光飽和染料進行PCR擴增，然后是高精度的熔解，在這個過程中隨著熒光的減少，可以監(jiān)測到DNA雙鏈向單鏈的轉變。這種變化是隨著DNA片段長度和序列變化而產生的，并
6、由熒光衍生物形成的曲線的峰值反映，峰值是HRM儀器通過感應解鏈過程引起的溫度(dF/dT)的的變化而出現的(Tindalletal.2009;Wuetal.2009)。僅僅含有一種類型的DNA序列的PCR反應（如二倍體的純合子模板）只產生一個峰的dF/dT曲線。雜合子模板（如有兩個不同等位基因的模板）會產生不同的純合子(A1A1,A2A2)和雜合子(A1A2)。由于純合子鏈的不完全結合，熔解溫度比雜合子低的多，結果在dF/dT曲線的峰值出現的較早(Maderetal.2008)。兩種均聚物的不同的序列通常不能形成兩個可以明顯區(qū)分的峰，如雜合子模板除形成一個與雜聚體相關的曲線外，一般
7、還形成一個與均聚物相關的一個峰值的dF/dT曲線(Maderetal.2008)。多拷貝位點或者無特異性的共擴增產物將會引起更復雜的雜聚體形狀和其它的dF/dT峰值。與之相反，任何峰值的缺失表明擴增過程中沒有進行充分的擴增。HRM除了應用于臨床上進行突變掃描，還可以用于數量遺傳學的基因分型(Smithetal.2010)及識別親緣關系相近的植物突變體的不同(Mackayetal.2008;Maderetal.2010)。Mader等人(2008)闡述了HRM在SSR分
