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1、高碘酸氧化和Smith降解準(zhǔn)備物品：容量瓶（25ml*2，50ml*2；茶色為好）、錫紙、堿式滴定管、定量濾紙高碘酸鈉、乙二醇、溴甲酚(紅)紫指示劑、0.005NNaOH(由0.1NNaOH稀釋20倍制得，使用前用鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)定)、NaBH4或KBH4、50%HAc、1MH2SO4、BaCO3、乙醇實(shí)驗(yàn)步驟：（1）準(zhǔn)確配置30mMNaIO450ml（320.8mgNaIO4，定容至50ml），用錫紙包好避光，取0.1ml稀釋至25ml，223nm處測定吸光值大于0.6方可使用。（注：此溶液必須現(xiàn)用現(xiàn)配。）（2）準(zhǔn)確稱取糖樣50mg（記錄
2、下準(zhǔn)確質(zhì)量），用少量水溶解于50ml容量瓶中，然后加入30mMNaIO425ml，蒸餾水定容，使NaIO4終濃度為15mM。用錫紙包好避光，放置在低溫暗處反應(yīng)，間隔時間(0、6、12、24、36、48、60……小時)取樣0.1ml，用蒸餾水稀釋250倍，以蒸餾水作空白對照，在223nm波長處測光密度值，直到光密度值恒定為止。（3）同時將剩余的30mMNaIO4稀釋為15mM，與反應(yīng)樣品同樣放置作為對照，待反應(yīng)結(jié)束時取出0.1ml，稀釋250倍后，用蒸餾水按不同比例稀釋，每濃度三個重復(fù)，測定223nm處的光密度值，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，NaIO4
3、濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。NaIO4濃度（Mm）03691215蒸餾水（ml）543210NaIO4溶液（ml）012345（4）通過查標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出高碘酸的消耗量。消耗高碘酸的量（mmol）=(反應(yīng)前高碘酸濃度-反應(yīng)后高碘酸濃度)*反應(yīng)體積（5）取2ml上述氧化液，加1滴溴甲酚(紅)紫作指示劑，用0.005NNaOH溶液滴定，計(jì)算得甲酸生成量。甲酸生成量（mmol）=（NaOH的準(zhǔn)確濃度*滴定用的體積/2ml）*反應(yīng)體積（6）加乙二醇終止高碘酸氧化反應(yīng)。流水及蒸餾水各透析24小時。濃縮至10ml，加入KBH470mg還原過夜。用50%
4、乙酸中和至pH為6~7，流水及蒸餾水各透析24小時。取1/3干燥后做完全酸水解和GC分析，剩余部分進(jìn)行Smith降解。（2）加入等體積的1MH2SO4，25℃水解40小時，BaCO3中和至pH為6，用定量濾紙過濾，濾液用蒸餾水透析8小時，袋外部分干燥做GC分析，濾液再用流水蒸餾水各透析24小時，袋內(nèi)部分水浴濃縮到適當(dāng)體積，加乙醇醇析，離心，上清及沉淀部分干燥后分別做完全酸水解和GC分析。高碘酸氧化、Smith降解實(shí)驗(yàn)原理：高碘酸氧化是一種選擇性的氧化反應(yīng)，它只能作用于多糖分子中連二羥基或連三羥基處。當(dāng)連二羥基的C-C鍵被氧化斷開后，產(chǎn)生相應(yīng)
5、的醛；當(dāng)連三羥基的C-C鍵被氧化斷開后，產(chǎn)生甲酸及相應(yīng)的醛。此反應(yīng)定量進(jìn)行，每斷開1molC-C鍵，消耗1mol高碘酸，每生成1mol甲酸對應(yīng)消耗2mol高碘酸。因此，通過測定高碘酸消耗量及甲酸生成量，便可以判斷糖苷鍵的位置、直鏈多糖的聚合度及支鏈多糖的分支數(shù)目等。高碘酸氧化產(chǎn)物經(jīng)硼氫化鉀還原，得到的多糖醇用稀酸在溫和條件下水解，可發(fā)生特異性降解，稱為Smith降解。Smith降解的特點(diǎn)是只打斷被高碘酸破壞的糖苷鍵，而未被高碘酸氧化的糖殘基仍連在糖鏈上。這樣，多糖醇經(jīng)Smith降解，就可以得到小分子的多元醇和未被破壞的多糖或寡糖片斷，對這些
6、產(chǎn)物進(jìn)行分析，便可以推斷出糖苷鍵的鍵型及其位置。下面以各種鍵型連接的葡聚糖為例，反應(yīng)式如下：以1→2或1→2,6位糖苷鍵連接的葡聚糖反應(yīng)式：以1→或1→6位糖苷鍵連接的葡聚糖反應(yīng)式：以1→4或1→4,6位糖苷鍵連接的葡聚糖反應(yīng)式：以1→3、1→3,6、1→2,3、1→2,4、1→3,4、1→2,3,4位糖苷鍵連接的葡聚糖反應(yīng)式：由此可見：（1）1mol1→或1→6位糖苷鍵連接的葡聚糖被高碘酸氧化時消耗2mol高碘酸，生成1mol甲酸；（2）1mol1→2或1→2,6、1→4、1→4,6位糖苷鍵連接的葡聚糖被高碘酸氧化時只消耗高碘酸，不生成甲
7、酸；（3）不被高碘酸氧化的己糖殘基糖苷鍵型為：1→3、1→3,6、1→2,3、1→2,4、1→3,4、1→2,3,4；（4）產(chǎn)生甘油的己糖殘基糖苷鍵型為：1→、1→6、1→2、1→2,6；（5）產(chǎn)生赤蘚醇的己糖殘基糖苷鍵型為：1→4、1→4,6；參考文獻(xiàn)
