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《熒光pcr原理、常用探針的優(yōu)缺點及多重熒光pcr技術(shù)進展》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、闡述熒光PCR原理、常用探針的優(yōu)缺點及多重熒光PCR技術(shù)進展摘要：熒光PCR技術(shù)是20世紀90年代中期發(fā)展起來的一種新型核酸定量技術(shù)。該技術(shù)具有實時監(jiān)測、快速、靈敏、精確等特點,是對原有PCR技術(shù)的革新,擴大了PCR的應(yīng)用范圍。本文綜述了熒光PCR技術(shù)的原理、常用探針的原理和優(yōu)缺點，PCR技術(shù)的研究方向及其應(yīng)用。關(guān)鍵詞：熒光PCR;探針;多重熒光PCR;應(yīng)用聚合酶鏈式反應(yīng)PCR是一種體外擴增DNA片斷的技術(shù)，根據(jù)擴增策略和檢測產(chǎn)物手段的不同，可分為定性PCR和定量PCR。實時PCR(rea-ltimequantitativepolymerasechainreaction,
2、RQ-PCR)又稱熒光定量PCR,是由美國AppliedBisystems公司于1996年研制出的一種新型核酸定量技術(shù),并隨著熒光PCR儀的推出而逐漸得到廣泛應(yīng)用[1]。該技術(shù)在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上運用熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)技術(shù),加入熒光標記探針,巧妙地把核酸擴增、雜交、光譜分析和實時檢測技術(shù)結(jié)合在一起,在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號的強弱來即時測定特異性產(chǎn)物的量,并據(jù)此推斷目的基因的初始量[2]。1.熒光PCR的原理熒光PCR技術(shù)是指在普通PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積
3、累監(jiān)測整個PCR反應(yīng)的進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量的方法。熒光PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，添加了一條標記了兩個熒光基團的探針。一個標記在探針的5’端，稱為熒光報告基團(R);另一個標記在探針的3’端，稱為熒光抑制基團(Q)。兩者可構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)，即5’端熒光基團所發(fā)出的熒光可被3’端的熒光抑制基團吸收或抑制。當二者距離較遠時，抑制作用消失，報告基團熒光信號增強[3]。熒光信號與PCR產(chǎn)物同比增長，隨PCR產(chǎn)物的增加而增強。熒光PCR方法就是利用此原理，在PCR反應(yīng)過程中，連續(xù)不斷地檢測反應(yīng)體系中熒光信號的變化。當信號增強到某一閩值(PCR反應(yīng)的前幾個循環(huán)
4、的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閉值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號標準偏差的10倍)時，此時的循環(huán)次數(shù)(Ct值)就被記錄下來，如圖1-1所示。該循環(huán)參數(shù)(Ct值)和PCR反應(yīng)體系中起始模板量的對數(shù)值之間有嚴格的線性關(guān)系。利用陽性梯度標準品的Ct值，制成標準曲線，圖1-2所示，再根據(jù)樣品的Ct值就可以準確確定起始模板的數(shù)量。2.探針的介紹2.1分子信標探針Tyagi和槍ammer(1996)首次建立了分子信標探針[4]，在同一寡核苷酸探針的5’端標記熒光素、3’端標記淬滅劑(DABCYL)、、其工作原理如圖1-3所示。分子信標探針能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針的樸琳環(huán)與目的DN
5、A堿基互補，樸琳環(huán)兩側(cè)為與目的DNA無關(guān)的堿基互補的臂。無目的DNA時，探針形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，熒光素靠近淬滅劑，熒光素接受的能量通過共振能量轉(zhuǎn)移至淬滅劑，DABCYL吸收能量后以熱量形式散失，結(jié)果不產(chǎn)生熒光。當探針遇到目的DNA分子時，形成一個比兩臂雜交更長也更穩(wěn)定的雜交，探針自發(fā)進行構(gòu)型變化，使兩臂分開，熒光素和淬滅劑隨之分開，此時在紫外照射下，熒光素產(chǎn)生熒光。影響分子信標探針構(gòu)型變化的參數(shù)主要有:臂長、臂序列GC含量、樸琳環(huán)長度和溶液鹽濃度，尤其是二價陽離子如Mg2+對兩臂形成的環(huán)有較強的穩(wěn)定作用，在M存在條件下，4-12個核苷酸可形成穩(wěn)定的雜交莖。樸琳環(huán)長度至少應(yīng)是臂長
6、的2倍，才能保證探針與目標DNA雜交及熒光素與淬滅劑分離。分子信標為熒光淬滅探針，空間上呈發(fā)夾狀，其環(huán)狀部分與靶序列互補，位于莖干部分的5’和3’端分別標記一個熒光分子和淬滅分子。在PCR反應(yīng)中分子信標與靶序列雜交，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開而發(fā)出熒光。分子信標的特殊發(fā)夾結(jié)構(gòu)使之具有高度的雜交特異性，能檢測單堿基突變。在PCR產(chǎn)物測定、遺傳分型、藥物篩選、突變分析、RNA測定[5]等領(lǐng)域正得到迅速應(yīng)用。2.2TaqMan探針TaqMan探針(亦稱水解探針)是一段5’端標記報告熒光基團(用R表示)，3’端標記淬滅熒光基團(用Q表示)的寡核營酸。報告熒光基團如FAM共價結(jié)合到寡核苷酸的5’
7、端[6]。TET、vlc、JoE及HEx也常用作報告熒光基團。所有這些報告熒光基團通常都由位于3’端的淬滅熒光基團TAMRA所淬滅。TaqMan探針的工作原理如圖1-4所示，當PCR反應(yīng)在退火階段時，一對引物和一條探針同時與目的基因片段結(jié)合，此時探針上R基團所發(fā)出的熒光信號被Q基團所吸收，儀器檢測不到熒光信號:當PCR反應(yīng)進行到延伸階段時，Taq酶在引物的引導(dǎo)下，以四種脫氧核昔酸為底物，根據(jù)堿基配對原則，沿著模板鏈合成新鏈，當鏈的延伸進行到探針結(jié)合部位時，受到探針的阻礙而無法繼續(xù)，此時Taq酶發(fā)揮它的5’-3’外切核酸酶的功能
