熒光探針定量pcr技術(shù)原理及應(yīng)用

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1、熒光探針定量PCR技術(shù)原理及應(yīng)用PCR技術(shù)是通過對基因的選擇性片段進(jìn)行體外高效擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)目的基因的檢測。熒光探針定量PCR（FQ-PCR）是一種新的基因定量檢測技術(shù)，國外文獻(xiàn)多用“實(shí)時定量PCR（realtimequantitativePCR）”或“TaqManPCR(以美國PE公司商標(biāo)命名)”。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針，巧妙地把核酸擴(kuò)增（PCR）、雜交及光譜技術(shù)結(jié)合在一起，從而實(shí)現(xiàn)了對目的基因的準(zhǔn)確定量檢測，正發(fā)展成為臨床實(shí)驗(yàn)診斷的常規(guī)技術(shù)。1.原理FQ-PCR的工作原理[1-3]是利用Taq酶的5’→3’外

2、切酶活性，在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入一個熒光標(biāo)記的探針。該探針可與引物包含序列內(nèi)的DNA模板發(fā)生特異性雜交，探針的5’端標(biāo)以熒光報(bào)告基團(tuán)FAM（6-羧基熒光素，熒光發(fā)射峰值在518mm處），靠近3’端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)TAMRA(6-羧基四甲基諾丹明,熒光發(fā)射峰值在582nm處)，兩者之間構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)。當(dāng)探針保持完整時，5’端熒光報(bào)告基團(tuán)所激發(fā)出的熒光信號被3’端淬滅基因吸收或抑制，不出現(xiàn)熒光信號變化。當(dāng)PCR反應(yīng)體系中有目的基因存在，就會擴(kuò)增出特異核酸片段，熒光探針即會根據(jù)堿基配對的原理與之雜交。當(dāng)PCR進(jìn)入延伸（復(fù)制）期，Ta

3、p酶從引物3’端開始,隨新鏈延伸沿DNA模板移動，當(dāng)移動到探針結(jié)合的位置時，其5’→3’端外切酶活性作用，將探針切斷（切口平移效應(yīng)）。熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)間的能量傳遞結(jié)構(gòu)被破壞，淬滅基團(tuán)的淬滅作用被解除，熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光信號釋放出來（圖1）。PCR反應(yīng)每復(fù)制一個特異核酸片段，就有一個探針被切斷，伴隨一個熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和PRC產(chǎn)物是一對一的關(guān)系，因此用熒光檢測技術(shù)檢測出的熒光信號有無或強(qiáng)弱，即代表擴(kuò)增產(chǎn)物有無或多少。由于熒光信號是代表擴(kuò)增產(chǎn)物的有效特異信號，無需進(jìn)行有效和無效信號分離，實(shí)現(xiàn)了儀器實(shí)時檢

4、測(圖2)，為新的PCR定量原理創(chuàng)造了條件。圖1.TaqManPCR反應(yīng)模式（A）聚合反應(yīng)：（B）鏈置換；（C）裂解；（D）聚合完成（R：FAM；Q：TAMRA；FP：上游引物；RP：下游引物）圖2.FQ-PCR實(shí)時動力學(xué)曲線ABI公司首先根據(jù)上述原理研制了ABI7700等系列定量PCR儀，在PCR反應(yīng)中設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)模板系列（一般5~7個標(biāo)準(zhǔn)濃度）反應(yīng)管和空白對照管。通過實(shí)時檢測反應(yīng)管中的熒光信號，計(jì)算出RQ+、RQ-、△RQ。RQ+代表樣品管熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)光強(qiáng)度與淬滅基團(tuán)發(fā)光強(qiáng)度的比率，RQ-代表空白管中二者的比率，△RQ（△RQ

5、=RQ+-RQ-）代表PCR過程中熒光信號變化量。當(dāng)熒光信號增強(qiáng)到某一閾值（根據(jù)熒光信號基線的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算出以99.7%的置信度大于平均值作為閾值）時，標(biāo)準(zhǔn)模板反應(yīng)管所用的循環(huán)次數(shù)（Ct值）就被記錄下來。Ct值與標(biāo)準(zhǔn)模板數(shù)量的對數(shù)值之間有嚴(yán)格的線性關(guān)系[3]，利用系列標(biāo)準(zhǔn)模板的Ct值，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，根據(jù)待測樣品的Ct值，就可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中確定待測樣品起始的DNA數(shù)量。根據(jù)數(shù)據(jù)處理，即可得出定量結(jié)果。探針設(shè)計(jì)一般應(yīng)符合以下條件[2]：①探針長度應(yīng)在20~40個堿基左右，以保證結(jié)合的特異性。②GC堿基含量在40%~60

6、%，避免單核苷酸序列的重復(fù)。③避免與引物發(fā)生雜交或重疊。④探針與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度要大于引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度，因此探針的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。另外，探針的濃度，探針與模板序列的同源性，探針與引物的距離都對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響。圖3.FQ-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線2.技術(shù)特點(diǎn)2.1封閉狀態(tài)下檢測，避免了擴(kuò)增產(chǎn)物污染而致的假陽性傳統(tǒng)PCR于反應(yīng)結(jié)束后取出反應(yīng)液，通過電泳染色和紫外儀觀察結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物在開放狀態(tài)下分析，對實(shí)險(xiǎn)室的污染是不可避免的。因污染而導(dǎo)致假陽性，成為PCR臨床實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)應(yīng)用一個難以逾越的障礙。FQ-PCR在全封

7、閉狀態(tài)下實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物分析，完全杜絕了擴(kuò)增產(chǎn)物污染而導(dǎo)致的假陽性。至于樣品間的污染，無論從目的基因的數(shù)量、濃度還是顆粒大小分析，都比較容易控制。我國PCR臨床應(yīng)用出現(xiàn)問題，產(chǎn)物污染所致假陽性是主要原因之一。2.2基因的定量檢測，擴(kuò)展了臨床應(yīng)用空間傳統(tǒng)PCR對基因的檢測只能定性，不能定量主要是由擴(kuò)增產(chǎn)物積累的動力學(xué)所決定的：①PCR產(chǎn)物在擴(kuò)增過程中呈指數(shù)積累，當(dāng)產(chǎn)物增加到一定程度，產(chǎn)物就停止了指數(shù)積累。不同起始模板，其指數(shù)增長期所用的循環(huán)是不同的，因此，不同數(shù)量基因的樣品在同一循環(huán)次數(shù)中積累的產(chǎn)物不能作為樣品基因定量的依據(jù)；

8、②PCR產(chǎn)物積累到一定程度就不能再增加，再進(jìn)入平臺期。為了擴(kuò)大PCR檢出的靈敏度通常要增加循環(huán)次數(shù)，循環(huán)次數(shù)增加使得樣品目的基因含量高的反應(yīng)管已進(jìn)入平臺期，終產(chǎn)物量并不代表樣品目的基因含量；③PCR反應(yīng)的管間擴(kuò)增效率差異總是存在的，既然PCR產(chǎn)物呈指數(shù)增長，由擴(kuò)