熒光定量pcr的原理及應(yīng)用

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1、大型儀器管理中心黃雪玲2010-9-27實時熒光定量PCR原理及其應(yīng)用熒光定量PCR儀的應(yīng)用基礎(chǔ)研究中基因表達(dá)豐度的測定；差異基因的表達(dá)檢測，基因型分析；臨床醫(yī)療領(lǐng)域病原體的檢測和基因診斷：包括特定基因的檢測、細(xì)菌和病毒等病原體的檢測；環(huán)境監(jiān)測，包括水質(zhì)、空氣的污染檢驗；檢驗檢疫工作：食品衛(wèi)生檢驗，轉(zhuǎn)基因作物的檢驗；法醫(yī)的遺傳學(xué)鑒定；PCR的反應(yīng)過程CycleFluorescence實時熒光定量PCR實時熒光定量PCR（Real-timeQ-PCR）技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積，實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過參照標(biāo)

2、準(zhǔn)曲線對反應(yīng)體系中未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR中的三個概念增長曲線(primarycurve)熒光閾值（threshold)CT值(CycleThreshold)增長曲線反映熒光強度與循環(huán)數(shù)的對應(yīng)關(guān)系CycleFluorescence域值：PCR擴增信號進入相對穩(wěn)定對數(shù)增長期時的熒光值。熒光域值（Threshold）的設(shè)定Ct值Ct值:C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值與起始模板的關(guān)系每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。起始

3、拷貝數(shù)越多，CT值越小；模板DNA的起始拷貝數(shù)越少，CT值越大。一般正常的CT值范圍在15-35之間，過大和過小都將影響實驗數(shù)據(jù)的精度。熒光定量PCR標(biāo)記方法內(nèi)摻式染料SYBRGreenI序列特異性探針TaqmanMolecularBeaconsDualProbes(FRET)引物特異性探針Amplifluor(Intergen)5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenISYBRGreen?I優(yōu)點：使用

4、方便，可以應(yīng)用于不同的模板靈敏，便宜缺點：與非特異性產(chǎn)物結(jié)合，但可以通過熔解曲線進行辨別熔解溫度(Tm值)Tm值：50%DNA變成單鏈時的溫度，此溫度與雙鏈DNA的長度、GC含量有關(guān)，可部分代表序列的特異性。MeltCurveAnalysisRQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation雙標(biāo)記探針（TaqmanProbe）優(yōu)點：對目標(biāo)序列有很高的特異性，在病原微生物特異性檢測上有獨特優(yōu)勢設(shè)計簡單，準(zhǔn)確性好缺點：只適合于一種特異目標(biāo)的檢測，相對價格略高雙標(biāo)記探針（TaqmanProbe）熒光定量PCR實驗技

5、術(shù)路線查詢目的基因序列選擇合適的熒光標(biāo)記方法選染料法則購買SyBrGreenI或相應(yīng)試劑盒；探針法則設(shè)計并合成熒光探針設(shè)計特異引物或探針引物設(shè)計的一般原則：產(chǎn)物長度在80-300bp之間產(chǎn)物GC含量在50-60%之間引物的GC含量在50-60%之間，熔解溫度在55-65℃之間應(yīng)避免引物中有連續(xù)的G或C，但推薦在引物的末端含有G或CPrimer5.0http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/PrimerQuest/Default.aspx?SequenceWarning=True熒光定量PCR實驗技術(shù)路

6、線實驗時先對普通PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，在條帶特異的情況下才能采用染料法進行熒光定量PCR實驗注意模板濃度：在普通PCR基礎(chǔ)上可以稀釋10~100倍引物濃度：0.4~0.9μM（一般略低于PCR引物量）熒光物質(zhì)濃度：按說明書操作，根據(jù)實驗結(jié)果優(yōu)化加樣準(zhǔn)確性：避免微小加樣熒光定量PCR實驗技術(shù)路線模板PlasmidDNA目的片段在PlasmidDNA中很易被擴增，可以適當(dāng)稀釋TotalDNA目的片段在TotalDNA中豐度相對較低，因此TotalDNA量要略高于PlasmidDNAcDNA以cDNA為模板時一般將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物原液稀釋10~5

7、0倍后作模板熒光定量PCR實驗技術(shù)路線熒光定量PCR反應(yīng)靈敏，微小差異都能被反映，實驗中要避免核酸污染，尤其是避免PCR產(chǎn)物污染。試劑反復(fù)凍融對實驗也有影響，各組分采用少量分裝保存低濃度模板反復(fù)凍融容易降解，少量分裝保存定量方法絕對定量相對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線由系列稀釋的已知濃度的樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品的濃度logN0=-CtlogE+logN絕對定量——未知濃度的樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品：含有目的片段的濃度已知的核酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，一般選取4-5個點（多于5個更好），被選點的模板濃度范圍要包括待測樣本濃度相對定量——在一定樣本中靶基因相對

8、于另一參照樣本的量的變化只需要了解相對于參照樣本目的基因的表達(dá)量的變化量，而不需要確切的知道基因的表達(dá)量具體是多少，采用相對定量即可。比