熒光定量PCR：簡介,原理,應(yīng)用

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1、熒光定量PCR：簡介，原理，應(yīng)用熒光定量PCR簡介熒光定量PCR檢測技術(shù)誕生至今已10多年的時間，而其應(yīng)用一直都沒廣泛展開，究其原因，無外乎受制于相關(guān)儀器、試劑和技術(shù)的發(fā)展。近期，尤其是08年以來，儀器和試劑是遍地開花，這也使科研人員均躍躍欲試，都想借此技術(shù)使H己的研究能突飛猛進(jìn)，發(fā)展勢頭通過查找每年所發(fā)表的文章數(shù)可一H了然。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計，在Medline數(shù)據(jù)庫中，用“Taqman”或”realtimePCR”作為關(guān)鍵詞檢索,1996年是19篇,1999年157篇，到2003年就高達(dá)2984篇,2009年會是多少呢？我們不得而知。但其迅猛的發(fā)展勢頭卻是不可更

2、改的，本公司真誠希望能和眾多研究人員共同努力，抓住這一大好時札為科研事業(yè)的發(fā)展貢獻(xiàn)自身的力雖:?；谶@一目標(biāo)，本公可長期以來對熒光定量PCR,無論是技術(shù)還是多年來的產(chǎn)品，均進(jìn)行了深入地研究，并及時推出更加優(yōu)界的熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)。熒光定量PCR原理熒光定量PCR最早稱TaqManPCR,后來也叫Real-TimePCR,是美國PE(PerkinElmer)公司1995年研制出來的-種新的核酸定最技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定最功能的。我原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累訃，熒光信號強(qiáng)度也等比例増

3、加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩孟，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)増產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的増加，PCR的終產(chǎn)物最與起始模板量Z間沒冇線性關(guān)系，根據(jù)故終的PCR產(chǎn)物量也不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物疑的對數(shù)值耳起始模板鼠之間存在線性關(guān)系，我們叮以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定就和比較的方便，在

4、實時熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個菲常重要的概念：熒光閾值和CT值(如下圖所示)。熒光域值(threshold)是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的-?個值，它可以設(shè)定在熒光倍號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺省設(shè)置是PCR反應(yīng)前3」5個循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍,UP：threshold.■°%11????15MM圖1?Ct值的確定ct值：是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值與起始模板的關(guān)系：研究農(nóng)明，每個模板的ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，ct值越小。利川已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品町作出標(biāo)準(zhǔn)Il

5、li線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱塑標(biāo)代表ct值如下圖所示。因此，只要獲得未知樣胡的ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。熒光定量檢測熒光定最檢測根據(jù)所使用的標(biāo)記物不同町分為熒光探針和熒光染料。熒光探針又包JSBeacon技術(shù)（分子信標(biāo)技術(shù)，以美國人Tagyi為代表）、TaqMan探針（以美國ABI公司為代表）和FRET技術(shù)（以羅氏公司為代表）等：熒光染料包括飽和熒光染料和非飽和熒光染料，非飽和熒光染料的典型代農(nóng)就是現(xiàn)在最常用的SYBRGreenI；飽和熒光染料有EvaGreen.LCGreen等。嵌合熒光染料法（SYBRGreenI）

6、SYBRGreenI是熒光定量PCRM常用的DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA非特異性結(jié)合。在游離狀態(tài)下，SYBRGreenI發(fā)出微弱的熒光，但?旦與雙鏈DNA結(jié)合，其熒光增加1000倍。所以，一?個反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號與出線的雙鏈DNA暈呈比列，且會隨擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而增加。SYBRGreenI熒光染料與DNA雙鏈的結(jié)合雙鏈DNA結(jié)合染料的優(yōu)點(diǎn)：實驗設(shè)計簡單，僅需要2個引物，不需要設(shè)計探針，無需設(shè)計多個探針即可以快速檢驗多個基因，且能夠進(jìn)行熔點(diǎn)曲線分析，檢驗擴(kuò)增反應(yīng)的特升性，低的初始成本，通用性好，因此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。熒光探針法（Taqman技術(shù)）

7、:PCR擴(kuò)増時，加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核昔酸,兩端分別標(biāo)記一個熒光報告基團(tuán)和一個熒光淬滅基團(tuán)，探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收,PCR儀檢測不到熒光信號；PCR擴(kuò)増時（在延仲階段），Taq酶的5'一3'切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就冇一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，這也是定就的基礎(chǔ)所在。其過程如下圖所示TaqMan°粉熒光定量PCR的應(yīng)用分子生物學(xué)研究1核酸定量分析。対傳染性疾病進(jìn)

8、行定量定性分析，病原微牛物或病毒含量的檢測，比如近期流行的屮型H1