實(shí)時(shí)熒光定量PCR簡(jiǎn)介

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1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR簡(jiǎn)介熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)從誕生到現(xiàn)在已經(jīng)有8年了，但是其應(yīng)用在近四年才迅猛增長(zhǎng)。在Medline數(shù)據(jù)庫(kù)中，用“Taqman”或”realtimePCR”作為關(guān)鍵詞檢索，在1996年僅有19篇，在1997年僅有28篇，在98、99、2000年分別達(dá)到了52、157、409篇，2003年已經(jīng)達(dá)到2984篇，相信在不久的將來(lái)會(huì)有更多的文章發(fā)表。針對(duì)實(shí)時(shí)PCR這一熱點(diǎn)領(lǐng)域，閃晶公司對(duì)它進(jìn)行了深入細(xì)致的研究，并且及時(shí)地為廣大科研人員推出這項(xiàng)技術(shù)服務(wù)。熒光定量PCR基本原理???Taqman技術(shù)：該技術(shù)以美國(guó)ABI公司為代表。PCR擴(kuò)增時(shí)，在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入

2、一個(gè)特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)，探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，PCR儀檢測(cè)不到熒光信號(hào)；PCR擴(kuò)增時(shí)（在延伸階段），Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，這也是定量的基礎(chǔ)所在。???Beacon技術(shù)：該技術(shù)以美國(guó)人Tagyi為代表。也是加入了熒光探針，但它是環(huán)狀的寡核苷酸探針，分別由莖部和環(huán)部組成，兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和

3、熒光猝滅基團(tuán)，在無(wú)靶序列的情況下，探針始終是環(huán)狀，報(bào)告基團(tuán)的熒光被猝滅基團(tuán)猝滅，使熒光檢測(cè)儀檢測(cè)不到熒光信號(hào)；而在有靶序列時(shí)，即在PCR的退火階段探針與靶序列結(jié)合，使熒光報(bào)告基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分開，這樣熒光儀可以檢測(cè)到熒光，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱代表了靶序列的多少。???FRET技術(shù)：該技術(shù)以Roche(羅氏公司)為代表。它的基本原理是：兩條直線型寡核苷酸探針，其中一條的3‘端標(biāo)記熒光激發(fā)基團(tuán)，另一條的5'端標(biāo)記熒光檢測(cè)基團(tuán)，在無(wú)靶序列的情況下，兩條探針分開，無(wú)法進(jìn)行能量的傳遞，這樣熒光儀不能檢測(cè)到熒光信號(hào)；而當(dāng)有靶序列時(shí)，即在PCR的退火階段兩條探針與靶序列結(jié)合，使得兩條探針上的熒

4、光基團(tuán)可以進(jìn)行能量的傳遞，這樣熒光儀就可以檢測(cè)到熒光信號(hào)，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱代表了靶序列的多少。??Ct值：是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如下圖所示）。??熒光域值（threshold）：是指PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold。???Ct值與起始模板的關(guān)系：研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系〔1〕，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值（如圖2所示）。因此

5、，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。熒光定量PCR應(yīng)用廣泛???可以對(duì)各種基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析，如：同一基因在不同組織中的表達(dá)差異、同一基因在不同藥物處理后的表達(dá)差異、轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)。過去最常用的高通量篩選基因表達(dá)差異的技術(shù)是cDNA芯片和差異顯示，但這兩種技術(shù)的缺點(diǎn)是只能定性而非完整意義上的定量分析。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)和高通道實(shí)時(shí)PCR儀的出現(xiàn)，無(wú)疑為這種檢測(cè)提供了極大的方便。???可以進(jìn)行點(diǎn)突變分析和等位基因分析，用不同的熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記Taqman探針，然后分別與野生型和突變型雜交，如果一種熒光信號(hào)明顯強(qiáng)于另一種熒光信號(hào)，則表明它是

6、純合子；如果兩種熒光信號(hào)都明顯增強(qiáng)，則表明它是雜合子。另外分子信標(biāo)（MolecularBeacon）就是專門為這種技術(shù)設(shè)計(jì)的探針。???可以進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性的分析，檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性對(duì)于研究個(gè)體對(duì)不同疾病的易感性或者個(gè)體對(duì)特定藥物的不同反應(yīng)有著重要的意義，因分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)的巧妙性，一旦SNP的序列信息是已知的，采用這種技術(shù)進(jìn)行高通量的SNP檢測(cè)將會(huì)變得簡(jiǎn)單而準(zhǔn)確。???可以進(jìn)行DNA甲基化檢測(cè)，DNA甲基化同人類的許多疾病有關(guān)，特別是癌癥，Laird報(bào)道了一種稱作Methylight的技術(shù)，在擴(kuò)增之前先處理DNA，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，

7、用特異性的引物和Taqman探針來(lái)區(qū)分甲基化和非甲基化的DNA，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。???對(duì)傳染性疾病進(jìn)行定量定性分析，這在我國(guó)應(yīng)用比較廣泛，大家比較熟悉。許多生產(chǎn)臨床PCR試劑的廠商已經(jīng)陸續(xù)推出了一系列的診斷試劑，如：肝炎系列、性病系列、腫瘤系列等等。