實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法簡介

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1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法簡介一．實(shí)時(shí)熒光定量PCR的基本原理理論上，PCR過程是按照2n（n代表PCR循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)的方式進(jìn)行模板的擴(kuò)增。但在實(shí)際的PCR反應(yīng)過程中，隨著反應(yīng)的進(jìn)行由于體系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰減）使得靶序列并非按指數(shù)方式擴(kuò)增，而是按線性的方式增長進(jìn)入平臺(tái)期。因此在起始模板量與終點(diǎn)的熒光信號強(qiáng)度間沒有可靠的相關(guān)性。如采用常規(guī)的終點(diǎn)檢測法（利用EB染色來判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的多少，從而間接的判斷起始拷貝量），即使起始模板量相同經(jīng)PCR擴(kuò)增、EB染色后也完全有可能得到不同的終點(diǎn)熒光信號強(qiáng)度。為了能準(zhǔn)確判斷樣

2、品中某基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）的起始拷貝數(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用新的參數(shù)——Ct值，定量的根本原理是Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對數(shù)成線性反比關(guān)系。Ct值是如何得到的在實(shí)時(shí)熒光定量PCR的過程中，靶序列的擴(kuò)增與熒光信號的檢測同時(shí)進(jìn)行，定量PCR儀全程采集熒光信號，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分析軟件自動(dòng)按數(shù)學(xué)算法扣除熒光本底信號并設(shè)定閾值從而得到每個(gè)樣品的Ct值。Ct值的定義Ct值中的“C”代表Cycle（循環(huán)），“t”代表檢測threshhold（閾值），其含義是PCR擴(kuò)增過程中熒光信號強(qiáng)度達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)；也可以理解為擴(kuò)增曲線與閾

3、值線交點(diǎn)所對應(yīng)的橫坐標(biāo)。Ct值與樣品中模板的對應(yīng)關(guān)系Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對數(shù)成線性反比關(guān)系（y=ax+b，x代表起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)，y代表Ct值）。與終點(diǎn)法相比利用Ct值的優(yōu)勢由于Ct值是反映實(shí)際PCR反應(yīng)過程中擴(kuò)增即將進(jìn)入指數(shù)期的參數(shù)，該參數(shù)幾乎不受試劑消耗等因素的影響，因此利用Ct值判斷的起始模板拷貝數(shù)更加精確，重復(fù)性也更好。傳統(tǒng)的終點(diǎn)檢測法是在PCR擴(kuò)增經(jīng)歷了指數(shù)擴(kuò)增期進(jìn)入平臺(tái)期后利用EB等染料染色來判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的多少，從而間接的判斷起始拷貝量，這種方法的精確度不高、重復(fù)性也不好。下圖中是96個(gè)復(fù)孔的實(shí)時(shí)擴(kuò)增

4、曲線（完全相同的反應(yīng)體系、相同的反應(yīng)protocol、相同的樣品起始濃度），可以看到Ct值具有很好的重復(fù)性，而終點(diǎn)的熒光信號強(qiáng)度差異達(dá)到300個(gè)單位。此外，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR還能從方法學(xué)上有效的防止PCR實(shí)驗(yàn)中交叉污染的問題。因?yàn)闊晒舛縋CR中模板的擴(kuò)增與檢測是同時(shí)進(jìn)行的，當(dāng)實(shí)驗(yàn)完成后即可獲得定量結(jié)果，直接丟棄含有大量擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)管，徹底避免了傳統(tǒng)方法中取出擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物對實(shí)驗(yàn)室造成二次污染的可能性。一．熒光定量PCR的2類方法（按熒光產(chǎn)生的原理分類）染料法（SYBRGreen法）染料法即利用SYBRGr

5、een分子產(chǎn)生的熒光信號來進(jìn)行樣品定量。該方法與常規(guī)的PCR類似，唯一的區(qū)別是在反應(yīng)體系中加入了SYBRGreen染料分子。該染料分子的激發(fā)波長為497nm，發(fā)射波長為520nm。與EB的性能類似，SYBRGreen也是一種扁平狀的分子，處于游離狀態(tài)時(shí)具有很低的熒光本底，當(dāng)反應(yīng)體系中存在dsDNA時(shí)，SYBRGreen能特異性的與之結(jié)合并在497nm激發(fā)下。染料法的優(yōu)點(diǎn)：1，無需設(shè)計(jì)、合成探針，實(shí)驗(yàn)成本低；2，使用方便，與常規(guī)PCR的操作幾乎相同。染料法的缺點(diǎn)：1，由于SYBRGreen與dsDNA的結(jié)合只具有結(jié)構(gòu)特異性而不具有

6、序列特異性，除了與特異性的靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合外，還能與在PCR擴(kuò)增過程中形成的引物二聚體、非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，從而造成擴(kuò)增效率的降低、結(jié)果的不準(zhǔn)確。因此采用該方法對于引物的設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化要求很高，確保反應(yīng)過程中沒有非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增；2，由于SYBRGreen的上述特點(diǎn)，該方法不能應(yīng)用于MultiplexQPCR技術(shù)。（在一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)檢測多個(gè)目的基因的表達(dá)情況）探針法（以TaqMan探針為例）探針法熒光定量PCR與常規(guī)PCR的不同之處在于：在上、下游引物外還加入了具有序列特異性的探針（探針本身具有熒光標(biāo)記），該探針根

7、據(jù)需要擴(kuò)增的靶序列設(shè)計(jì)因此只能與待檢測序列結(jié)合，與染料法相比提高了實(shí)驗(yàn)的特異性。目前市場上的探針主要種類有：TaqMan、MolecularBeacon、Scorpions、Hybirdization等，其中以TaqMan探針應(yīng)用最廣泛。TaqMan探針的結(jié)構(gòu)：長度與普通PCR引物類似，大約20bp左右。在5’與3’端各標(biāo)記有一個(gè)熒光基團(tuán)，5’的熒光基團(tuán)稱為報(bào)告基團(tuán)（Report），3’的熒光基團(tuán)稱為淬滅基團(tuán)（Quencher）。TaqMan探針的性能：在探針結(jié)構(gòu)完整的情況下用特定的波長激發(fā)報(bào)告基團(tuán)，由于報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的空間

8、位置很近，因此報(bào)告基團(tuán)能夠通過FRET（FluorescenceResonanceEnergyTransfer）將接受的能量轉(zhuǎn)移到淬滅基團(tuán)，使后者以發(fā)射熒光或熱量的方式釋放能量，而報(bào)告基團(tuán)并不發(fā)射特定波長的熒光信號。TaqMan探針法工作原理：?變性（95°C）