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1、實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用(RealtimeQuantitativePCR)肖曉秋重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院講座提綱實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的幾種方法介紹實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的幾種方法介紹實時熒光定量技術(shù)的應(yīng)用實時熒光定量PCR定義在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法實時熒光定量PCR原理：實時原理常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴(kuò)增反應(yīng)實時檢測實時定量PCR技術(shù)
2、：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析實時熒光定量PCR原理：實時原理實時熒光定量PCR原理：定量原理介紹三個概念：擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值如何對起始模板定量？通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進(jìn)行定量分析實時熒光定量PCR原理--擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線圖：橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度每個循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號的收集熒光基團(tuán)熒光檢測元件實時熒光定量PCR原理---熒光閾值熒光信號閾值（threshold）：前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseli
3、ne），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99真正的信號:熒光信號超過域值實時熒光定量PCR原理----Ct值Ct值的定義：PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t)value實時熒光定量PCR原理--Ct值的重現(xiàn)性橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量Ct值的特點：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點處產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)
4、性實時熒光定量PCR原理------定量原理實時熒光定量PCR原理------定量原理實時熒光定量PCR原理---------標(biāo)準(zhǔn)曲線模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量確定未知樣品的C(t)值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量Sample實時熒光定量PCR原理絕對定量25講座提綱實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的幾種方法介紹實時熒光定量PCR實驗設(shè)計及應(yīng)用實時熒光定量PCR原理實時熒光
5、定量PCR的幾種方法介紹實時熒光定量PCR實驗設(shè)計及應(yīng)用非特異性熒光標(biāo)記：1、SYBRGreen特異性熒光標(biāo)記：2、TaqMan3、MolecularBeacon實時熒光定量PCR原理--DNA產(chǎn)物的熒光標(biāo)記實時熒光定量PCR方法1--SYBRGreen法SYBRGreenSYBRGreen法工作機(jī)理SYBRGreen能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時，DNA雙鏈分開，無熒光復(fù)性和延伸時，形成雙鏈DNA，SYBRGreen發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。SYBRGreen實時熒光定量PCR原理SYB
6、RGreenI工作原理5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲線分析溫度熒光強(qiáng)度TmTm值：DNA解鏈一半時的溫度實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI融解曲線分析將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)-dIdTTmSYBRGreen法融解曲線分析融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確非特異性產(chǎn)物Cyclenum
7、berFlourescencCk102Ck104SampleCyclenumberLogofDNAconcentrationSYBRGreen法定量原理模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量SYBRGreen法---PCR反應(yīng)的建立反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化:SYBRGreen使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測Primer：引物的特異性高，否則擴(kuò)增有雜帶，定量不準(zhǔn)MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物反應(yīng)Buffer體系的優(yōu)化
8、反應(yīng)溫度和時間參數(shù):由酶和引物決定其他與常規(guī)PCR相同SYBRGreen法應(yīng)用范圍起始模板的測定基因型的分析融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應(yīng)的條件，對
