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1、CodeNo.RR716研究用SYBR?PrimeScript?miRNART-PCRKit說明書v201211Da目錄內容頁碼●制品說明1●制品內容1●保存2●試劑盒原理2●特長3●RNA樣品制備3●操作注意4●操作方法51．Poly(A)加尾反應和反轉錄反應52．RealTimePCR反應5◆應用ThermalCyclerDiceRealTimeSystem擴增儀的操作方法5◆應用ABIPRISM7000/7700/7900HT，67300/7500/7500FastReal-TimePCRSystem的操作方法◆應用LightCyclerRealTimePCR
2、擴增儀的操作方法8●實驗條件的選擇9●實驗例9●引物設計說明10●Q&A11●制品說明本制品中含有合成Poly(A)多聚尾和合成cDNA所需的全部試劑，可以將樣品中的miRNA（起始樣品可以是TotalRNA、smallRNAfragments等任何包含miRNA的樣品）經過一次反應合成為1stStrandcDNA（樣品中的mRNA、snoRNA等其它形式的RNA也會同時被反轉錄成cDNA）。本試劑盒經過特別的優(yōu)化，將Poly(A)加尾反應和cDNA合成反應同步進行，在1小時內即可完成miRNA1stStrandcDNA合成，且產物無需進行純化，可直接使用PCR反應
3、試劑SYBRPremixExTaqII進行RealTimePCR定量檢測，從而準確簡便地對miRNA（或mRNA、snoRNA等其它RNA分子）進行表達量分析。由于本試劑盒對反應樣品進行的Poly(A)加尾以及cDNA合成不具有特異性，所以經過一次反轉錄得到的產物可以用于多種miRNA以及mRNA、snoRNA等的定量分析。本制品可以從10pg~5μgTotalRNA反轉錄合成miRNAs、mRNAs和snoRNA等的1stStrandcDNA，再通過RealTimePCR反應，可以在寬廣的定量區(qū)域內得到良好的標準曲線，對靶基因進行準確定量、檢測，重復性好，可信度高
4、?！裰破穬热荩?0μl反應×200次）本制品由[A.反轉錄反應試劑]和[B.PCR反應試劑]兩部分構成。A.反轉錄反應試劑1.2×miRNAReactionBufferMix（forRealTime）*1200μl2.miRNAPrimeScriptRTEnzymeMix40μl3.0.1%BSA40μl4.Uni-miRqPCRPrimer（10μM）200μl5.RNasefreedH2O1ml×26.EasyDilution（forRealTimePCR）*21ml*1含有dNTPMixture、Mg2+和反轉錄用的UniversalAdaptorPrimer
5、。*2制作標準曲線時梯度稀釋DNA或RNA標準品的稀釋液。模板DNA或模板RNA如果用水或TE稀釋時，由于受Microtube的吸附作用等原因的影響，往往不能準確地進行稀釋，導致實驗結果精度降低。使用本制品時，即使稀釋至低濃度也能夠進行準確地稀釋，容易在寬廣范圍內獲得準確定量的標準曲線。EASYDilution也可以單獨購買（CodeNo.9160）。EASYDilution請與本公司RealTimePCR試劑組合使用，對于其他公司同類制品的適用性本公司尚未進行確認。B.PCR反應試劑SYBRPremixExTaqII（PerfectRealTime）（2×Conc
6、.）*31.0ml×5支ROXReferenceDye（50×Conc.）*4200μl×1支ROXReferenceDyeII（50×Conc.）*4200μl×1支*3內含TaKaRaExTaqHS，dNTPMixture，Mg2+，SYBRGreenI等。*4只使用在LifeTechnologies、Agilent等公司的RealTimePCR擴增儀上，用以校正孔與孔之間產生的熒光信號誤差。ABIPRISM7000/7700/7900HT和7300Real-TimePCRSystem使用ROXReferenceDye，7500Real-TimePCRSyste
7、m和7500FastReal-TimePCRSystem使用ROXReferenceDyeII。ThermalCyclerDiceRealTimeSystem、LightCycler等RealTimePCR擴增儀時不必使用。-1-●保存[A.反轉錄反應試劑]請于-20℃保存。[B.PCR反應試劑]4℃保存6個月性能穩(wěn)定。請避光保存，避免污染。若長期保存，請存放于-80℃，勿存放于-20℃。產品融解后請于4℃保存，并在6個月內用完?！裨噭┖性?.反轉錄反應試劑盒中的miRNAPrimeScriptRTEnzymeMix中包含Poly(A)Polymerase和反
