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《實(shí)時(shí)熒光定量PCR》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、CodeNo.RR716研究用SYBR?PrimeScript?miRNART-PCRKit說明書v201211Da目錄內(nèi)容頁碼●制品說明1●制品內(nèi)容1●保存2●試劑盒原理2●特長3●RNA樣品制備3●操作注意4●操作方法51．Poly(A)加尾反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)52．RealTimePCR反應(yīng)5◆應(yīng)用ThermalCyclerDiceRealTimeSystem擴(kuò)增儀的操作方法5◆應(yīng)用ABIPRISM7000/7700/7900HT，67300/7500/7500FastReal-TimePCRSystem的操作方法◆應(yīng)用LightCyclerRealTimePCR
2、擴(kuò)增儀的操作方法8●實(shí)驗(yàn)條件的選擇9●實(shí)驗(yàn)例9●引物設(shè)計(jì)說明10●Q&A11●制品說明本制品中含有合成Poly(A)多聚尾和合成cDNA所需的全部試劑，可以將樣品中的miRNA（起始樣品可以是TotalRNA、smallRNAfragments等任何包含miRNA的樣品）經(jīng)過一次反應(yīng)合成為1stStrandcDNA（樣品中的mRNA、snoRNA等其它形式的RNA也會(huì)同時(shí)被反轉(zhuǎn)錄成cDNA）。本試劑盒經(jīng)過特別的優(yōu)化，將Poly(A)加尾反應(yīng)和cDNA合成反應(yīng)同步進(jìn)行，在1小時(shí)內(nèi)即可完成miRNA1stStrandcDNA合成，且產(chǎn)物無需進(jìn)行純化，可直接使用PCR反應(yīng)
3、試劑SYBRPremixExTaqII進(jìn)行RealTimePCR定量檢測(cè)，從而準(zhǔn)確簡便地對(duì)miRNA（或mRNA、snoRNA等其它RNA分子）進(jìn)行表達(dá)量分析。由于本試劑盒對(duì)反應(yīng)樣品進(jìn)行的Poly(A)加尾以及cDNA合成不具有特異性，所以經(jīng)過一次反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物可以用于多種miRNA以及mRNA、snoRNA等的定量分析。本制品可以從10pg~5μgTotalRNA反轉(zhuǎn)錄合成miRNAs、mRNAs和snoRNA等的1stStrandcDNA，再通過RealTimePCR反應(yīng)，可以在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)得到良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)靶基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量、檢測(cè)，重復(fù)性好，可信度高
4、?！裰破穬?nèi)容（50μl反應(yīng)×200次）本制品由[A.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑]和[B.PCR反應(yīng)試劑]兩部分構(gòu)成。A.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑1.2×miRNAReactionBufferMix（forRealTime）*1200μl2.miRNAPrimeScriptRTEnzymeMix40μl3.0.1%BSA40μl4.Uni-miRqPCRPrimer（10μM）200μl5.RNasefreedH2O1ml×26.EasyDilution（forRealTimePCR）*21ml*1含有dNTPMixture、Mg2+和反轉(zhuǎn)錄用的UniversalAdaptorPrimer
5、。*2制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)梯度稀釋DNA或RNA標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液。模板DNA或模板RNA如果用水或TE稀釋時(shí)，由于受Microtube的吸附作用等原因的影響，往往不能準(zhǔn)確地進(jìn)行稀釋，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果精度降低。使用本制品時(shí)，即使稀釋至低濃度也能夠進(jìn)行準(zhǔn)確地稀釋，容易在寬廣范圍內(nèi)獲得準(zhǔn)確定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。EASYDilution也可以單獨(dú)購買（CodeNo.9160）。EASYDilution請(qǐng)與本公司RealTimePCR試劑組合使用，對(duì)于其他公司同類制品的適用性本公司尚未進(jìn)行確認(rèn)。B.PCR反應(yīng)試劑SYBRPremixExTaqII（PerfectRealTime）（2×Conc
6、.）*31.0ml×5支ROXReferenceDye（50×Conc.）*4200μl×1支ROXReferenceDyeII（50×Conc.）*4200μl×1支*3內(nèi)含TaKaRaExTaqHS，dNTPMixture，Mg2+，SYBRGreenI等。*4只使用在LifeTechnologies、Agilent等公司的RealTimePCR擴(kuò)增儀上，用以校正孔與孔之間產(chǎn)生的熒光信號(hào)誤差。ABIPRISM7000/7700/7900HT和7300Real-TimePCRSystem使用ROXReferenceDye，7500Real-TimePCRSyste
7、m和7500FastReal-TimePCRSystem使用ROXReferenceDyeII。ThermalCyclerDiceRealTimeSystem、LightCycler等RealTimePCR擴(kuò)增儀時(shí)不必使用。-1-●保存[A.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑]請(qǐng)于-20℃保存。[B.PCR反應(yīng)試劑]4℃保存6個(gè)月性能穩(wěn)定。請(qǐng)避光保存，避免污染。若長期保存，請(qǐng)存放于-80℃，勿存放于-20℃。產(chǎn)品融解后請(qǐng)于4℃保存，并在6個(gè)月內(nèi)用完。●試劑盒原理1.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒中的miRNAPrimeScriptRTEnzymeMix中包含Poly(A)Polymerase和反
