實(shí)時(shí)熒光定量pcr掃盲

《實(shí)時(shí)熒光定量pcr掃盲》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理和實(shí)驗(yàn)無論是對遺傳病(如地中海貧血和血友病)、傳染病(如肝炎和艾滋病)或腫瘤進(jìn)行基因診斷，還是研究藥物對基因表達(dá)水平的影響，或者監(jiān)控藥物和療法的治療效果，定量PCR技術(shù)都可以發(fā)揮很大作用。定量PCR技術(shù)的最新進(jìn)展是實(shí)時(shí)熒光定量。該技術(shù)借助于熒光信號(hào)來檢測PCR產(chǎn)物，一方面提高了靈敏度，另一方面還可以做到PCR每循環(huán)一次就收集一個(gè)數(shù)據(jù)，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確地確定CT值，從而根據(jù)CT值確定起始DNA拷貝數(shù)，做到了真正意義上的DNA定量。這是DNA定量技術(shù)的一次飛躍。　　根據(jù)最終得到的數(shù)據(jù)不同，定量PCR可以分為相對定量和絕對定量

2、兩種。典型的相對定量如比較經(jīng)過不同方式處理的兩個(gè)樣本中基因表達(dá)水平的高低變化，得到的結(jié)果是百分比；絕對定量則需要使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本中基因的拷貝數(shù)或濃度。根據(jù)所使用的技術(shù)不同，熒光定量PCR又可以分為TaqMan探針和SYBRGreenI熒光染料兩種方法。比較而言，探針雜交技術(shù)在原理上更為嚴(yán)格，所得數(shù)據(jù)更為精確；熒光染料技術(shù)則成本更為低廉，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更為簡便。在選擇實(shí)驗(yàn)方案時(shí)要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shù)據(jù)精度的要求來決定?！　《繉?shí)驗(yàn)與定性實(shí)驗(yàn)最大的不同，是要考慮統(tǒng)計(jì)學(xué)要求并對數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的校正，以消除偶然誤差。因此重復(fù)實(shí)驗(yàn)和設(shè)立內(nèi)對照非常重要。由于各種各樣

3、的客觀原因，這一點(diǎn)在實(shí)踐中往往被輕視或忽視，需要著重強(qiáng)調(diào)。當(dāng)然，與定性實(shí)驗(yàn)一樣，定量PCR也要設(shè)立陰性和陽性對照，以監(jiān)控試劑和實(shí)驗(yàn)操作方面可能出現(xiàn)的問題?！　?為什么終點(diǎn)定量不準(zhǔn)確？　　我們都知道理論上PCR是一個(gè)指數(shù)增長的過程，但是實(shí)際的PCR擴(kuò)增曲線并不是標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是S形曲線。這是因?yàn)殡S著PCR循環(huán)的增多，擴(kuò)增規(guī)模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率越來越低，產(chǎn)物增長的速度就逐漸減緩。當(dāng)所有的Taq酶都被飽和以后，PCR就進(jìn)入了平臺(tái)期。由于各種環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用，不同的PCR反

4、應(yīng)體系進(jìn)入平臺(tái)期的時(shí)機(jī)和平臺(tái)期的高低都有很大變化，難以精確控制。所以，即使是重復(fù)實(shí)驗(yàn)，各種條件基本一致，最后得到的DNA拷貝數(shù)也是完全不一樣的，波動(dòng)很大（圖1）。圖1同一個(gè)樣本重復(fù)96次PCR的擴(kuò)增曲線　　　　傳統(tǒng)的定量方法，如溴乙錠染色或放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的光密度掃描等，測定的都是PCR的終產(chǎn)物，而不是起始DNA拷貝數(shù)。由于PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)?！　τ诮^大多數(shù)實(shí)驗(yàn)，比如甲肝的診斷、藥物療效的監(jiān)測等，需要測定的都是PCR放大之前標(biāo)本中的DNA原始拷貝數(shù)，經(jīng)過PCR擴(kuò)增

5、以后的DNA拷貝數(shù)已經(jīng)不能反映真實(shí)情況。在這種情況下，就不能采用終點(diǎn)定量，而要根據(jù)CT值確定DNA起始拷貝的數(shù)量?！　?為什么CT值與起始模板拷貝數(shù)成線性關(guān)系？　　CT值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。從圖1的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中可以直觀地看到，盡管平臺(tái)期DNA拷貝數(shù)波動(dòng)很大，CT值卻是相對固定的。如果用不同濃度的DNA作PCR，可以看出DNA濃度越高，CT值越小。DNA濃度每增加1倍，CT值減小1個(gè)循環(huán)。CT值與模板DNA的起始拷貝數(shù)成反比。6　　這一結(jié)論可以從數(shù)學(xué)上嚴(yán)格證明。為使表達(dá)式簡便，以下推導(dǎo)忽略

6、PCR效率等細(xì)節(jié)。如果考慮這些因素，可以在方程上增加修正項(xiàng)。這些修正項(xiàng)的增加并不改變方程的線性性質(zhì)。　　一般地，我們有Rn=RB+XO(1+EX)nRS,也就是說第n次PCR循環(huán)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度(Rn)等于背景信號(hào)強(qiáng)度(RB)加上每個(gè)分子的熒光強(qiáng)度(即單位熒光強(qiáng)度，RS)與分子數(shù)目的乘積。當(dāng)循環(huán)次數(shù)n=CT時(shí)，則有RT=RB+XO(1+EX)CTRS。兩邊取對數(shù)，得log(RT-RB)=logX0+CTlog(1+Ex)+logRs。整理此式，CTlog(1+Ex)=-logX0+log(RT-RB)–logRs?！　∷詫τ诿恳粋€(gè)特定的PCR反應(yīng)

7、來說，EX、RT、RB和RS都是常數(shù)，所以CT值與logX0成反比，也就是說，CT值與起始模板拷貝數(shù)(X0)的對數(shù)成反比，起始DNA濃度每增加1倍，CT值減小1個(gè)循環(huán)。根據(jù)CT值的定量是精確和嚴(yán)格的，而傳統(tǒng)的終點(diǎn)定量則比較粗放?！　∪绻x者有興趣的話，也可以假設(shè)PCR的效率(即Ex)為100%，從上式推算出定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的最佳斜率和CT值的最佳范圍?！　?怎樣確定CT值？　　實(shí)驗(yàn)操作中，CT值定義為在基線上方產(chǎn)生可檢測到的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的熒光發(fā)射時(shí)所對應(yīng)的PCR循環(huán)次數(shù)（圖2）?！盎€上方”也就是閾值高度的量化定義是基線范圍內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差

8、的10倍。閾值所在的橫線與PCR擴(kuò)增曲線的交點(diǎn)所指的PCR循環(huán)次數(shù)就是CT值?；€范圍的定義是從第3個(gè)循環(huán)起到CT值前3個(gè)