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1、實(shí)時熒光定量PCR方法簡介一.實(shí)時熒光定量PCR的基本原理理論上,PCR過程是按照2n(n代表PCR循環(huán)的次數(shù))指數(shù)的方式進(jìn)行模板的擴(kuò)增。但在實(shí)際的PCR反應(yīng)過程中,隨著反應(yīng)的進(jìn)行由于體系中各成分的消耗(主要是由于聚合酶活力的衰減)使得靶序列并非按指數(shù)方式擴(kuò)增,而是按線性的方式增長進(jìn)入平臺期。因此在起始模板量與終點(diǎn)的熒光信號強(qiáng)度間沒有可靠的相關(guān)性。如采用常規(guī)的終點(diǎn)檢測法(利用EB染色來判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的多少,從而間接的判斷起始拷貝量),即使起始模板量相同經(jīng)PCR擴(kuò)增、EB染色后也完全有可能得到不同的終點(diǎn)熒光信號強(qiáng)度。為了能準(zhǔn)確
2、判斷樣品中某基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)的起始拷貝數(shù),實(shí)時熒光定量PCR采用新的參數(shù)——Ct值,定量的根本原理是Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對數(shù)成線性反比關(guān)系。Ct值是如何得到的在實(shí)時熒光定量PCR的過程中,靶序列的擴(kuò)增與熒光信號的檢測同時進(jìn)行,定量PCR儀全程采集熒光信號,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分析軟件自動按數(shù)學(xué)算法扣除熒光本底信號并設(shè)定閾值從而得到每個樣品的Ct值。Ct值的定義Ct值中的“C”代表Cycle(循環(huán)),“t”代表檢測threshhold(閾值),其含義是PCR擴(kuò)增過程中熒光信號強(qiáng)度達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù);也可以理解為
3、擴(kuò)增曲線與閾值線交點(diǎn)所對應(yīng)的橫坐標(biāo)。Ct值與樣品中模板的對應(yīng)關(guān)系Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對數(shù)成線性反比關(guān)系(y=ax+b,x代表起始模板拷貝數(shù)的對數(shù),y代表Ct值)。與終點(diǎn)法相比利用Ct值的優(yōu)勢由于Ct值是反映實(shí)際PCR反應(yīng)過程中擴(kuò)增即將進(jìn)入指數(shù)期的參數(shù),該參數(shù)幾乎不受試劑消耗等因素的影響,因此利用Ct值判斷的起始模板拷貝數(shù)更加精確,重復(fù)性也更好。傳統(tǒng)的終點(diǎn)檢測法是在PCR擴(kuò)增經(jīng)歷了指數(shù)擴(kuò)增期進(jìn)入平臺期后利用EB等染料染色來判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的多少,從而間接的判斷起始拷貝量,這種方法的精確度不高、重復(fù)性也不好。下圖中是9
4、6個復(fù)孔的實(shí)時擴(kuò)增曲線(完全相同的反應(yīng)體系、相同的反應(yīng)protocol、相同的樣品起始濃度),可以看到Ct值具有很好的重復(fù)性,而終點(diǎn)的熒光信號強(qiáng)度差異達(dá)到300個單位。此外,采用實(shí)時熒光定量PCR還能從方法學(xué)上有效的防止PCR實(shí)驗(yàn)中交叉污染的問題。因?yàn)闊晒舛縋CR中模板的擴(kuò)增與檢測是同時進(jìn)行的,當(dāng)實(shí)驗(yàn)完成后即可獲得定量結(jié)果,直接丟棄含有大量擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)管,徹底避免了傳統(tǒng)方法中取出擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定時擴(kuò)增產(chǎn)物對實(shí)驗(yàn)室造成二次污染的可能性。一.熒光定量PCR的2類方法(按熒光產(chǎn)生的原理分類)染料法(SYBRGreen法)
5、染料法即利用SYBRGreen分子產(chǎn)生的熒光信號來進(jìn)行樣品定量。該方法與常規(guī)的PCR類似,唯一的區(qū)別是在反應(yīng)體系中加入了SYBRGreen染料分子。該染料分子的激發(fā)波長為497nm,發(fā)射波長為520nm。與EB的性能類似,SYBRGreen也是一種扁平狀的分子,處于游離狀態(tài)時具有很低的熒光本底,當(dāng)反應(yīng)體系中存在dsDNA時,SYBRGreen能特異性的與之結(jié)合并在497nm激發(fā)下。染料法的優(yōu)點(diǎn):1,無需設(shè)計、合成探針,實(shí)驗(yàn)成本低;2,使用方便,與常規(guī)PCR的操作幾乎相同。染料法的缺點(diǎn):1,由于SYBRGreen與dsDNA
6、的結(jié)合只具有結(jié)構(gòu)特異性而不具有序列特異性,除了與特異性的靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合外,還能與在PCR擴(kuò)增過程中形成的引物二聚體、非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合,從而造成擴(kuò)增效率的降低、結(jié)果的不準(zhǔn)確。因此采用該方法對于引物的設(shè)計及實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化要求很高,確保反應(yīng)過程中沒有非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增;2,由于SYBRGreen的上述特點(diǎn),該方法不能應(yīng)用于MultiplexQPCR技術(shù)。(在一個反應(yīng)管中同時檢測多個目的基因的表達(dá)情況)探針法(以TaqMan探針為例)探針法熒光定量PCR與常規(guī)PCR的不同之處在于:在上、下游引物外還加入了具有序列特異性的探
7、針(探針本身具有熒光標(biāo)記),該探針根據(jù)需要擴(kuò)增的靶序列設(shè)計因此只能與待檢測序列結(jié)合,與染料法相比提高了實(shí)驗(yàn)的特異性。目前市場上的探針主要種類有:TaqMan、MolecularBeacon、Scorpions、Hybirdization等,其中以TaqMan探針應(yīng)用最廣泛。TaqMan探針的結(jié)構(gòu):長度與普通PCR引物類似,大約20bp左右。在5’與3’端各標(biāo)記有一個熒光基團(tuán),5’的熒光基團(tuán)稱為報告基團(tuán)(Report),3’的熒光基團(tuán)稱為淬滅基團(tuán)(Quencher)。TaqMan探針的性能:在探針結(jié)構(gòu)完整的情況下用特定的波長
8、激發(fā)報告基團(tuán),由于報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的空間位置很近,因此報告基團(tuán)能夠通過FRET(FluorescenceResonanceEnergyTransfer)將接受的能量轉(zhuǎn)移到淬滅基團(tuán),使后者以發(fā)射熒光或熱量的方式釋放能量,而報告基團(tuán)并不發(fā)射特定波長的熒光信號。TaqMan探針法工作原理:?變性(95°C)