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1、實時熒光定量PCR方法簡介一．實時熒光定量PCR的基本原理理論上，PCR過程是按照2n（n代表PCR循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)的方式進行模板的擴增。但在實際的PCR反應過程中，隨著反應的進行由于體系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰減）使得靶序列并非按指數(shù)方式擴增，而是按線性的方式增長進入平臺期。因此在起始模板量與終點的熒光信號強度間沒有可靠的相關性。如采用常規(guī)的終點檢測法（利用EB染色來判斷擴增產物的多少，從而間接的判斷起始拷貝量），即使起始模板量相同經(jīng)PCR擴增、EB染色后也完全有可能得到不同的終點熒光信號強度。為了能準確
2、判斷樣品中某基因轉錄產物（mRNA）的起始拷貝數(shù)，實時熒光定量PCR采用新的參數(shù)——Ct值，定量的根本原理是Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對數(shù)成線性反比關系。Ct值是如何得到的在實時熒光定量PCR的過程中，靶序列的擴增與熒光信號的檢測同時進行，定量PCR儀全程采集熒光信號，實驗結束后分析軟件自動按數(shù)學算法扣除熒光本底信號并設定閾值從而得到每個樣品的Ct值。Ct值的定義Ct值中的“C”代表Cycle（循環(huán)），“t”代表檢測threshhold（閾值），其含義是PCR擴增過程中熒光信號強度達到閾值所需要的循環(huán)數(shù)；也可以理解為
3、擴增曲線與閾值線交點所對應的橫坐標。Ct值與樣品中模板的對應關系Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對數(shù)成線性反比關系（y=ax+b，x代表起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)，y代表Ct值）。與終點法相比利用Ct值的優(yōu)勢由于Ct值是反映實際PCR反應過程中擴增即將進入指數(shù)期的參數(shù)，該參數(shù)幾乎不受試劑消耗等因素的影響，因此利用Ct值判斷的起始模板拷貝數(shù)更加精確，重復性也更好。傳統(tǒng)的終點檢測法是在PCR擴增經(jīng)歷了指數(shù)擴增期進入平臺期后利用EB等染料染色來判斷擴增產物的多少，從而間接的判斷起始拷貝量，這種方法的精確度不高、重復性也不好。下圖中是9
4、6個復孔的實時擴增曲線（完全相同的反應體系、相同的反應protocol、相同的樣品起始濃度），可以看到Ct值具有很好的重復性，而終點的熒光信號強度差異達到300個單位。此外，采用實時熒光定量PCR還能從方法學上有效的防止PCR實驗中交叉污染的問題。因為熒光定量PCR中模板的擴增與檢測是同時進行的，當實驗完成后即可獲得定量結果，直接丟棄含有大量擴增產物的反應管，徹底避免了傳統(tǒng)方法中取出擴增產物進行電泳鑒定時擴增產物對實驗室造成二次污染的可能性。一．熒光定量PCR的2類方法（按熒光產生的原理分類）染料法（SYBRGreen法）
5、染料法即利用SYBRGreen分子產生的熒光信號來進行樣品定量。該方法與常規(guī)的PCR類似，唯一的區(qū)別是在反應體系中加入了SYBRGreen染料分子。該染料分子的激發(fā)波長為497nm，發(fā)射波長為520nm。與EB的性能類似，SYBRGreen也是一種扁平狀的分子，處于游離狀態(tài)時具有很低的熒光本底，當反應體系中存在dsDNA時，SYBRGreen能特異性的與之結合并在497nm激發(fā)下。染料法的優(yōu)點：1，無需設計、合成探針，實驗成本低；2，使用方便，與常規(guī)PCR的操作幾乎相同。染料法的缺點：1，由于SYBRGreen與dsDNA
6、的結合只具有結構特異性而不具有序列特異性，除了與特異性的靶序列擴增產物結合外，還能與在PCR擴增過程中形成的引物二聚體、非特異性擴增產物結合，從而造成擴增效率的降低、結果的不準確。因此采用該方法對于引物的設計及實驗條件的優(yōu)化要求很高，確保反應過程中沒有非特異性產物的擴增；2，由于SYBRGreen的上述特點，該方法不能應用于MultiplexQPCR技術。（在一個反應管中同時檢測多個目的基因的表達情況）探針法（以TaqMan探針為例）探針法熒光定量PCR與常規(guī)PCR的不同之處在于：在上、下游引物外還加入了具有序列特異性的探
7、針（探針本身具有熒光標記），該探針根據(jù)需要擴增的靶序列設計因此只能與待檢測序列結合，與染料法相比提高了實驗的特異性。目前市場上的探針主要種類有：TaqMan、MolecularBeacon、Scorpions、Hybirdization等，其中以TaqMan探針應用最廣泛。TaqMan探針的結構：長度與普通PCR引物類似，大約20bp左右。在5’與3’端各標記有一個熒光基團，5’的熒光基團稱為報告基團（Report），3’的熒光基團稱為淬滅基團（Quencher）。TaqMan探針的性能：在探針結構完整的情況下用特定的波長
8、激發(fā)報告基團，由于報告基團與淬滅基團的空間位置很近，因此報告基團能夠通過FRET（FluorescenceResonanceEnergyTransfer）將接受的能量轉移到淬滅基團，使后者以發(fā)射熒光或熱量的方式釋放能量，而報告基團并不發(fā)射特定波長的熒光信號。TaqMan探針法工作原理：?變性（95°C）
