資源描述：
《實時熒光定量pcr方法簡介》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、實時熒光定量PCR方法簡介一．實時熒光定量PCR的基本原理理論上，PCR過程是按照2n（n代表PCR循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)的方式進行模板的擴增。但在實際的PCR反應過程中，隨著反應的進行由于體系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰減）使得靶序列并非按指數(shù)方式擴增，而是按線性的方式增長進入平臺期。因此在起始模板量與終點的熒光信號強度間沒有可靠的相關性。如采用常規(guī)的終點檢測法（利用EB染色來判斷擴增產(chǎn)物的多少，從而間接的判斷起始拷貝量），即使起始模板量相同經(jīng)PCR擴增、EB染色后也完全有可能得到不同的終點熒光信號強度。為了能準確判斷樣品中某基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRN
2、A）的起始拷貝數(shù)，實時熒光定量PCR采用新的參數(shù)——Ct值，定量的根本原理是Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對數(shù)成線性反比關系。Ct值是如何得到的在實時熒光定量PCR的過程中，靶序列的擴增與熒光信號的檢測同時進行，定量PCR儀全程采集熒光信號，實驗結(jié)束后分析軟件自動按數(shù)學算法扣除熒光本底信號并設定閾值從而得到每個樣品的Ct值。Ct值的定義Ct值中的“C”代表Cycle（循環(huán)），“t”locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zheji
3、ang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame代表檢測threshhold（閾值），其含義是PCR擴增過程中熒光信號強度達到閾值所需要的循環(huán)數(shù)；也可以理解為擴增曲線與閾值線交點所對應的橫坐標。Ct值與樣品中模板的對應關系Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對數(shù)成線性反比關系（y=ax+b，x代表起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)，y代表Ct值）。與終點法相比利用Ct值的優(yōu)勢由于Ct值是反映實際P
4、CR反應過程中擴增即將進入指數(shù)期的參數(shù)，該參數(shù)幾乎不受試劑消耗等因素的影響，因此利用Ct值判斷的起始模板拷貝數(shù)更加精確，重復性也更好。傳統(tǒng)的終點檢測法是在PCR擴增經(jīng)歷了指數(shù)擴增期進入平臺期后利用EB等染料染色來判斷擴增產(chǎn)物的多少，從而間接的判斷起始拷貝量，這種方法的精確度不高、重復性也不好。下圖中是96個復孔的實時擴增曲線（完全相同的反應體系、相同的反應protocol、相同的樣品起始濃度），可以看到Ct值具有很好的重復性，而終點的熒光信號強度差異達到300個單位。locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenex
5、tdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame此外，采用實時熒光定量PCR還能從方法學上有效的防止PCR實驗中交叉污染的問題。因為熒光定量PCR中模板的擴增與檢測是同時進行的，當實驗完成后即可獲得定量結(jié)果，直接丟棄含有大量擴增產(chǎn)物的反應管，徹底避免了傳統(tǒng)方法中取出擴增產(chǎn)物進行電泳鑒定時擴增產(chǎn)物
6、對實驗室造成二次污染的可能性。一．熒光定量PCR的2類方法（按熒光產(chǎn)生的原理分類）染料法（SYBRGreen法）染料法即利用SYBRGreen分子產(chǎn)生的熒光信號來進行樣品定量。該方法與常規(guī)的PCR類似，唯一的區(qū)別是在反應體系中加入了SYBRGreen染料分子。該染料分子的激發(fā)波長為497nm，發(fā)射波長為520nm。與EB的性能類似，SYBRGreen也是一種扁平狀的分子，處于游離狀態(tài)時具有很低的熒光本底，當反應體系中存在dsDNA時，SYBRGreen能特異性的與之結(jié)合并在497nm激發(fā)下。染料法的優(yōu)點：1，無需設計、合成探針，實驗成本低；2，使用方便，
7、與常規(guī)PCR的操作幾乎相同。染料法的缺點：1，由于SYBRGreen與dsDNA的結(jié)合只具有結(jié)構特異性而不具有序列特異性，除了與特異性的靶序列擴增產(chǎn)物結(jié)合外，還能與在PCR擴增過程中形成的引物二聚體、非特異性擴增產(chǎn)物結(jié)合，從而造成擴增效率的降低、結(jié)果的不準確。因此采用該方法對于引物的設計及實驗條件的優(yōu)化要求很高，確保反應過程中沒有非特異性產(chǎn)物的擴增；2，由于SYBRGreen的上述特點，該方法不能應用于MultiplexQPCR技術。（在一個反應管中同時檢測多個目的基因的表達情況）探針法（以TaqMan探針為例）探針法熒光定量PCR與常規(guī)PCR的不同之處
8、在于：在上、下游引物外還加入了具有序列特異性的探針（探針本身具有熒光標記），該探
