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《地高辛標(biāo)記探針的southern 雜交》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、地高辛標(biāo)記探針的Southern雜交（DIGHighPrimerDNALabelingandDetectionStarterKitI，Cat.No.11745832910，RocheDiagnosticsGmbH，Germany）1.探針標(biāo)記步驟（20μl體系）：1)將10ng-1μg這個(gè)需要測(cè)好。可能是1μl也可能是4μl。還可以是300ng-3μg。模板DNA用無菌去離子水補(bǔ)足至16μl。2)沸水浴或干浴鍋98℃10分鐘，使DNA變性成單鏈并迅速冰浴冷卻。3)充分混勻DIG-highPrimer（1#管），并取4μl至變性DNA管，混勻并離心？10秒鐘，離
2、心到管壁無水掛即可。。4)37℃溫育1小時(shí)或過夜（最大到不超過20小時(shí)）。5)停止反應(yīng)，加2μl0.2MEDTA（pH8.0）或65℃加熱10分鐘-20℃保存?zhèn)溆??！?.探針標(biāo)記效率檢測(cè)：將地高辛標(biāo)記好的探針作一系列的稀釋，點(diǎn)到一條尼龍膜上，同時(shí)用地高辛標(biāo)記的controlDNA作對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，120℃固定30分鐘；然后用地高辛抗體免疫檢測(cè)，按BNT/BCIP顯色步驟顯色；比較顯色結(jié)果，選擇帶有可以接受的背景的最高探針濃度做正式的雜交。操作步驟如下：1)根據(jù)表1DIG-HighPrimeDNA標(biāo)記及檢測(cè)試劑盒理想條件下探針的標(biāo)記產(chǎn)量將標(biāo)記的探針稀釋到1ng/μl，
3、將試劑盒提供的controlDNA稀釋到1ng/μl(原始濃度是5ng/μl)，然后按照表2作一系列的稀釋探針及controlDNA表1DIG-HighPrimeDNA標(biāo)記及檢測(cè)試劑盒理想條件下探針標(biāo)記產(chǎn)量TemplateDNA1h20h10ng45ng600ng30ng130ng1050ng100ng270ng1500ng300ng450ng2000ng1000ng850ng2300ng3000ng1350ng2650ng表2探針DNA及ControlDNA系列表TubeDNA(μl)FromTube#DNAdilutionbuffer(μl)Dilutio
4、nFinalconcentration1?Dilutedorginal??1ng/μl2211981:10010pg/μl3152351:3.33pg/μl452451:101pg/μl553451:100.3pg/μl654451:100.1pg/μl755451:100.03pg/μl856451:10總的稀釋比例是：1:1050.01pg/μl90-50-01)將上述稀釋的2-9號(hào)管的controlDNA及探針DNA各取1μl點(diǎn)膜2)120℃固定30分鐘或紫外交鏈3-5分鐘3)將膜放入裝有20mlMaleicacidbuffer的塑料器皿中，室溫振蕩2分
5、鐘4)將膜放入10mlBlockingsolution中室溫溫育30分鐘5)將膜放入10mlAntibodysolution中室溫溫育30分鐘6)用10mlWashingbuffer洗2次，每次15分鐘7)在10mlDetectionbuffer平衡2-5分鐘8)將膜放入2ml新配制的Colorsubstratesolution中暗室條件下顯色。顯色過程中不要搖動(dòng)或振蕩9)當(dāng)斑點(diǎn)或帶顯示出來后，用50ml滅菌的雙蒸水洗膜5分鐘，照相染色至0.1pg的ControlDNA出現(xiàn)斑點(diǎn)，比較標(biāo)記的探針與ControlDNA染色情況計(jì)算出地高辛標(biāo)記的DNA的量：如果0.
6、1pg的探針及對(duì)照稀釋點(diǎn)都顯色，則探針標(biāo)記理想；如果0.1pg的對(duì)照顯色，0.1pg的標(biāo)記探針沒顯色，但0.3pg顯色，則計(jì)算探針濃度（約為理想濃度的1/3）以確定雜交時(shí)加多少探針（25ng探針/ml雜交液）；如果0.1pg的對(duì)照顯色，但標(biāo)記探針0.3pg的斑點(diǎn)沒顯色，則應(yīng)重新標(biāo)記探針。（轉(zhuǎn)膜被省略。Capillarytransfer1%瓊脂糖凝膠，40V電泳過夜，切角標(biāo)記。對(duì)于植物基因組，去嘌呤實(shí)驗(yàn)不要超過20min。）去嘌呤緩沖液：placethegelinaplastictray.coverwith250mMHClpartialdepurination.
7、agitategentlyuntilthebromophenolblue溴酚藍(lán)dyeturnsyellow(5minutes).agitateafurther15minutesandrinsewithdistilledwater.堿變性液：1.5mol/LNaCl,0.5mol/LNaOH中和液：0.5mol/LTris-HCL(pH=8.0),1.5mol/LNaCl20×SSC：2mol/LNaCl,0.3mol/L檸檬酸鈉（pH=7.0）2×SSC：0.3mol/LNaCl,0.03mol/L檸檬酸鈉（pH=7.0）關(guān)于凝膠處理Note:donotput
8、ethidiumbromideinto
