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《地高辛標記探針的southern 雜交》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、地高辛標記探針的Southern雜交（DIGHighPrimerDNALabelingandDetectionStarterKitI，Cat.No.11745832910，RocheDiagnosticsGmbH，Germany）1.探針標記步驟（20μl體系）：1)將10ng-1μg這個需要測好?？赡苁?μl也可能是4μl。還可以是300ng-3μg。模板DNA用無菌去離子水補足至16μl。2)沸水浴或干浴鍋98℃10分鐘，使DNA變性成單鏈并迅速冰浴冷卻。3)充分混勻DIG-highPrimer（1#管），并取4μl至變性DNA管，混勻并離
2、心？10秒鐘，離心到管壁無水掛即可。。4)37℃溫育1小時或過夜（最大到不超過20小時）。5)停止反應(yīng)，加2μl0.2MEDTA（pH8.0）或65℃加熱10分鐘-20℃保存?zhèn)溆??！?.探針標記效率檢測：將地高辛標記好的探針作一系列的稀釋，點到一條尼龍膜上，同時用地高辛標記的controlDNA作對照標準，120℃固定30分鐘；然后用地高辛抗體免疫檢測，按BNT/BCIP顯色步驟顯色；比較顯色結(jié)果，選擇帶有可以接受的背景的最高探針濃度做正式的雜交。操作步驟如下：1)根據(jù)表1DIG-HighPrimeDNA標記及檢測試劑盒理想條件下探針的標記產(chǎn)量
3、將標記的探針稀釋到1ng/μl，將試劑盒提供的controlDNA稀釋到1ng/μl(原始濃度是5ng/μl)，然后按照表2作一系列的稀釋探針及controlDNA表1DIG-HighPrimeDNA標記及檢測試劑盒理想條件下探針標記產(chǎn)量TemplateDNA1h20h10ng45ng600ng30ng130ng1050ng100ng270ng1500ng300ng450ng2000ng1000ng850ng2300ng3000ng1350ng2650ng表2探針DNA及ControlDNA系列表TubeDNA(μl)FromTube#DNAd
4、ilutionbuffer(μl)DilutionFinalconcentration1?Dilutedorginal??1ng/μl2211981:10010pg/μl3152351:3.33pg/μl452451:101pg/μl553451:100.3pg/μl654451:100.1pg/μl755451:100.03pg/μl856451:10總的稀釋比例是：1:1050.01pg/μl90-50-01)將上述稀釋的2-9號管的controlDNA及探針DNA各取1μl點膜2)120℃固定30分鐘或紫外交鏈3-5分鐘3)將膜放入裝有2
5、0mlMaleicacidbuffer的塑料器皿中，室溫振蕩2分鐘4)將膜放入10mlBlockingsolution中室溫溫育30分鐘5)將膜放入10mlAntibodysolution中室溫溫育30分鐘6)用10mlWashingbuffer洗2次，每次15分鐘7)在10mlDetectionbuffer平衡2-5分鐘8)將膜放入2ml新配制的Colorsubstratesolution中暗室條件下顯色。顯色過程中不要搖動或振蕩9)當(dāng)斑點或帶顯示出來后，用50ml滅菌的雙蒸水洗膜5分鐘，照相染色至0.1pg的ControlDNA出現(xiàn)斑點，比
6、較標記的探針與ControlDNA染色情況計算出地高辛標記的DNA的量：如果0.1pg的探針及對照稀釋點都顯色，則探針標記理想；如果0.1pg的對照顯色，0.1pg的標記探針沒顯色，但0.3pg顯色，則計算探針濃度（約為理想濃度的1/3）以確定雜交時加多少探針（25ng探針/ml雜交液）；如果0.1pg的對照顯色，但標記探針0.3pg的斑點沒顯色，則應(yīng)重新標記探針。（轉(zhuǎn)膜被省略。Capillarytransfer1%瓊脂糖凝膠，40V電泳過夜，切角標記。對于植物基因組，去嘌呤實驗不要超過20min。）去嘌呤緩沖液：placethegelinap
7、lastictray.coverwith250mMHClpartialdepurination.agitategentlyuntilthebromophenolblue溴酚藍dyeturnsyellow(5minutes).agitateafurther15minutesandrinsewithdistilledwater.堿變性液：1.5mol/LNaCl,0.5mol/LNaOH中和液：0.5mol/LTris-HCL(pH=8.0),1.5mol/LNaCl20×SSC：2mol/LNaCl,0.3mol/L檸檬酸鈉（pH=7.0）2×S
8、SC：0.3mol/LNaCl,0.03mol/L檸檬酸鈉（pH=7.0）關(guān)于凝膠處理Note:donotputethidiumbromideinto
