分子生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)

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1、分子生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一質(zhì)粒DNA的小量制備一、實(shí)驗(yàn)原理?載體:要把一個(gè)有用的外源基因通過(guò)基因工程手段，送進(jìn)細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)，需要運(yùn)載工具，攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的這種工具就叫載體（vector）。載體的設(shè)計(jì)和應(yīng)用是DNA體外重組的重要條件。作為基因工程的載體必須具備下列條件:(1)是一個(gè)復(fù)制子，載體有復(fù)制點(diǎn)才能使與它結(jié)合的外源基因復(fù)制繁殖；（2）載體在受體細(xì)胞中能大量增殖，只有高復(fù)制率才能使外源基因在受體細(xì)胞中大量擴(kuò)增；（3）載體DNA鏈上有1到幾個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一識(shí)別與切割位點(diǎn)，便于外源基因的插入；（4）載體具有選擇性的遺傳標(biāo)記，如有抗四環(huán)素基因（Tcr），抗新霉素基因（Ne

2、r）等，以此知道它是否已進(jìn)入受體細(xì)胞，也可根據(jù)這個(gè)標(biāo)記將受體細(xì)胞從其他細(xì)胞中分離篩選出來(lái)。細(xì)菌質(zhì)粒具備上述條件，它是基因工程中常用的載體之一。質(zhì)粒（plasmid）是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小在1～120kb之間，具有雙鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA分子，主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中。質(zhì)粒具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能使子代細(xì)胞保持它們恒定的拷貝數(shù)，可表達(dá)它攜帶的遺傳信息。它可獨(dú)立游離在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，也可以整合到細(xì)菌染色體中，它離開宿主的細(xì)胞就不能存活，而它控制的許多生物學(xué)功能也是對(duì)宿主細(xì)胞的補(bǔ)償。質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，一般分為兩種類型：嚴(yán)密控制型（stringentcontrol）和松弛控制型

3、（relaxedcontrol）。前者只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制，染色體不復(fù)制時(shí)，它也不復(fù)制。每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只含有1個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒分子。后者的質(zhì)粒在整個(gè)細(xì)胞周期中隨時(shí)復(fù)制，在細(xì)胞里，它有許多拷貝，一般在20個(gè)以上。通常大的質(zhì)粒如F因子等，拷貝數(shù)較少，復(fù)制受到嚴(yán)格控制。小的質(zhì)粒，如ColEⅠ質(zhì)粒（含有產(chǎn)生大腸桿菌素E1基因），拷貝數(shù)較多，復(fù)制不受嚴(yán)格控制。在使用蛋白質(zhì)合成抑制劑－氯霉素時(shí)，染色體DNA復(fù)制受阻，而松弛型ColEⅠ質(zhì)粒繼續(xù)復(fù)制12－16h，由原來(lái)20多個(gè)拷貝可擴(kuò)增至1000－3000個(gè)拷貝，此時(shí)質(zhì)粒DNA占總DNA的含量由原來(lái)的2％增加到40％－50％。質(zhì)粒pBR322、pUC1

4、9就是由ColEⅠ衍生的質(zhì)粒。所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括三個(gè)基本步驟:培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離和純化質(zhì)粒DNA。采用溶菌酶可破壞菌體細(xì)胞壁，十二烷基硫酸鈉（SDS）可使細(xì)胞壁解，經(jīng)溶菌酶和陰離子去污劑（SDS）處理后，細(xì)菌染色體DNA纏繞附著在細(xì)胞壁碎片上，離心時(shí)易被沉淀出來(lái)，而質(zhì)粒DNA則留在清液中。用乙醇沉淀、洗滌，可得到質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA的相對(duì)分子量一般在106－107范圍內(nèi)，如質(zhì)粒pBR322的相對(duì)分子質(zhì)量為2.8×106，質(zhì)粒pUC19的相對(duì)分子質(zhì)量為1.7×106。在細(xì)胞內(nèi)，共價(jià)閉環(huán)DNA（covalentlyclosedcircularDNA，簡(jiǎn)稱cc

5、cDNA）常以超螺旋形式存在。如果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，這種松弛型的分子叫做開環(huán)DNA（opencircularDNA，簡(jiǎn)稱ocDNA）。在電泳時(shí)，同一質(zhì)粒如以cccDNA形式存在，它比其開環(huán)和線狀DNA的泳動(dòng)速度快，因此在本實(shí)驗(yàn)中，自制質(zhì)粒DNA在電泳凝膠中呈現(xiàn)3條區(qū)帶。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．掌握最常用的提取質(zhì)粒DNA的方法和檢測(cè)方法。2．了解制備原理及各種試劑的作用。三、實(shí)驗(yàn)材料和試劑材料：大腸桿菌E.coli，質(zhì)粒pegf。試劑：1.LB培養(yǎng)基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，用NaOH調(diào)pH至7.3左右。如固體培養(yǎng)基則

6、添加15g/L瓊脂。2.溶液Ⅰ（pH8.0G.E.T緩沖液）：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDTA。滅菌后存放。3.溶液Ⅱ（0.2mol/LNaOH(內(nèi)含1％SDS)）：預(yù)先配制1％SDS母液，臨用前一天晚上加入0.2mol/LNaOH，4℃保存。4.溶液Ⅲ（pH4.8乙酸鉀溶液）：5mol/L乙酸鉀60mL、冰乙酸11.5mL、雙蒸餾水28.5mL。5.酚/氯仿液(V/V＝1/1)：酚為重蒸酚，配制時(shí)，先將氯仿中加入異戊醇，使其體積比為24:1，然后等量的加入重蒸酚，混勻，并用0.1mol/LTris-HCl(pH7.6)抽提幾次以平衡這一混

7、合物，于棕色瓶中存放，并在上面覆蓋等體積的0.01mol/LTris-HCl(pH7.6)，4℃保存。1.無(wú)水乙醇2.70％乙醇3.pH8.0TE緩沖液：10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA，其中含RNA酶20μg/mL。儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、臺(tái)式高速離心機(jī)、臺(tái)式小型振蕩器、EP管(1.5mL微量離心管)、加樣器(20uL～lmL)、吸頭。四、操作步驟（一）培養(yǎng)細(xì)菌將