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兩歧雙歧桿菌固態(tài)培養(yǎng)的研究摘要:兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)ATCC29521在含質(zhì)量分數(shù)為20%惰性固態(tài)物質(zhì)(纖維素)的MRS固態(tài)培養(yǎng)基中,若營養(yǎng)物的質(zhì)量分數(shù)比液體培養(yǎng)基中營養(yǎng)物的質(zhì)量分數(shù)提高1倍,則菌體生長量也相應(yīng)提高1倍(達119@108cfu/g).經(jīng)過3種固態(tài)基質(zhì)作比較后,發(fā)現(xiàn)大豆渣和麥麩為佳,前者的含菌量最高達514@108cfu/g,后者含菌量最高可達213@108cfu/g.通過加入可中和所產(chǎn)酸量的CaCO3,并用緩沖液代替水配制培養(yǎng)基,結(jié)果發(fā)現(xiàn)用pH618的緩沖液配制培養(yǎng)基,培養(yǎng)后含菌量可達16@108cfu/g,比對照的液體培養(yǎng)提高了1114倍.通過/液-固先后培養(yǎng)0并測定其中活菌數(shù)的變化,進一步證明了固態(tài)培養(yǎng)的優(yōu)越性.關(guān)鍵詞:兩歧雙歧桿菌;固態(tài)培養(yǎng)法;益生菌雙歧桿菌是國內(nèi)外正在快速發(fā)展的微生態(tài)制劑(益生菌)中的主要菌種.在我國,盡管目前市場上利用雙歧桿菌制成的活菌制劑品種繁多、劑型多樣,但普遍存在著活菌含量低、保質(zhì)期短和/億活菌價0過高等缺點[1].因此,努力探索該菌的基本生長規(guī)律和高密度生長條件,就具有十分重要的實際和理論意義.常規(guī)的雙歧桿菌培養(yǎng)用的幾乎都是液體培養(yǎng)法.可是在我們的研究中卻發(fā)現(xiàn),用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后,不論是靜止培養(yǎng)還是攪拌培養(yǎng),其生長量總是很低.從液體培養(yǎng)的缺點出發(fā),并參考了雙歧桿菌在人體腸道內(nèi)固態(tài)環(huán)境下可以達到高約1010cfu/g的高密度生長的情況,我們提出了對雙歧桿菌進行固態(tài)培養(yǎng)的設(shè)想.在檢索了國內(nèi)外大量文獻后,發(fā)現(xiàn)目前尚無采用此培養(yǎng)方法的報道.現(xiàn)將初步研究結(jié)果作一報道.1材料和方法菌種:兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)ATCC29521;培養(yǎng)基:MRS培養(yǎng)基[2];固態(tài)基質(zhì):纖維 素(CelluloseSP-100,ServaCo.),麥麩,大豆渣,芋艿渣;厭氧培養(yǎng)裝置:825-A型厭氧罐(沈陽人民醫(yī)院生產(chǎn)),亨蓋特試管及丁基橡膠塞;儀器:METROHM654pH計(madebyMetrohmHerisauSwitzerland),CDE-280多功能食品攪拌器(順德市科圣電器實業(yè)有限公司).雙歧桿菌的培養(yǎng)法:1菌種活化.取少量菌種接入裝有9mL液體MRS培養(yǎng)基的亨蓋特試管中,然后抽氣、充氮,重復(fù)3次后,置于37e厭氧培養(yǎng)24h.o固態(tài)培養(yǎng).稱取固態(tài)基質(zhì)(纖維素、麥麩、大豆渣等)放入10mL小燒杯中,加MRS培養(yǎng)液,使固態(tài)基質(zhì)和培養(yǎng)液的總重量為5g,并且不論哪種基質(zhì),都使培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的質(zhì)量分數(shù)為514%,即0127g.滅菌后,接入活化的菌液1mL,放入?yún)捬豕拗薪?jīng)抽氣換氣后在37e下厭氧培養(yǎng).雙歧桿菌計數(shù)用馬-周試管計數(shù)法[4].大豆渣的制作:將新鮮的大豆用水浸泡24h,然后用食品攪拌器攪碎,擠去漿液.芋艿渣的制作:將新鮮的芋艿切成小塊,然后用食品攪伴器攪碎,擠去汁液即成.*收稿日期:1999-07-01作者簡介:王雪奇(1972)),女,碩士研究生;復(fù)旦大學(xué)微生物及微生物工程系,上海200433基金項目:上海市高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)發(fā)展基金資助項目(95A44)2結(jié)果2.1營養(yǎng)物質(zhì)量分數(shù)的變化對雙歧桿菌生長量的影響在纖維素的質(zhì)量分數(shù)為20%的固態(tài)培養(yǎng)基中,比較了不同質(zhì)量分數(shù)的營養(yǎng)物(MRS培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分)對ATCC29521生長量的影響,結(jié)果見圖1.由圖1看出,營養(yǎng)成分的質(zhì)量分數(shù)相同的培養(yǎng)基中,固態(tài)培養(yǎng)基比液態(tài)培養(yǎng)基獲得的活菌數(shù)多.營養(yǎng)成分的質(zhì)量分數(shù)為1018%的固態(tài)培養(yǎng)基獲得的活菌數(shù)最多, 比營養(yǎng)成分的質(zhì)量分數(shù)為514%的固態(tài)培養(yǎng)基活菌數(shù)高出1倍,比營養(yǎng)成分的質(zhì)量分數(shù)為1612%的固態(tài)圖1營養(yǎng)物含量不同的MRS纖維素培養(yǎng)基對ATCC29521生長的影響Fig.1Numberofcfu/gofATCC29521inthecellulosesolidmediumwithdifferentconcentrationofnutrient培養(yǎng)基高出近214倍.2.2合適固態(tài)基質(zhì)的選擇分別以大豆渣、麥麩、芋艿渣和纖維素為基質(zhì),以液體MRS培養(yǎng)基為對照,進行培養(yǎng).比較的結(jié)果見圖2.從圖2可以看出,麥麩和大豆渣是較好的基質(zhì).以大豆渣為基質(zhì),活菌數(shù)達到了215@108cfu/g;以麥麩為基質(zhì),活菌數(shù)達到了211@108cfu/g.2.3最適生長pH值的選擇從文獻上得知,雙歧桿菌的最適生長pH值在610~710之間,pH在515以下停止生長[5].事實上,在培養(yǎng)的過程中,由于雙歧桿菌產(chǎn)酸,培養(yǎng)基的pH值一直在不斷地降低.圖2ATCC29521在以大豆渣、芋艿渣和麥麩為基質(zhì)的培養(yǎng)基中的生長情況Fig.2Numberofcfu/gofATCC29521inthethreediffer-entsolidmediawithsoybeanresidue,mincedtaroandwheatbran為了解決這一問題,我們在含有纖維素固態(tài)基質(zhì)的MRS培養(yǎng)基中加入01073gCaCO3以中和所產(chǎn)的酸,再分別加上pH值為515,610和618檸檬 酸-Na2HPO4緩沖液[6],經(jīng)24h培養(yǎng)后計數(shù).結(jié)果見圖3.由圖3可以看出,pH618為最適pH值.加CaCO3后再加緩沖液起到了較好的培養(yǎng)效果.其中,培養(yǎng)基中加了CaCO3和pH618的緩沖液后,活菌數(shù)達到了116@109cfu/g,這比液體對照高出了1014倍.2.4液-固態(tài)先后培養(yǎng)試驗在5mL的液體培養(yǎng)基中接入1mL菌液,厭氧培養(yǎng)24h后得6mL菌液,計活菌數(shù)(稱前次培養(yǎng)).將前次培養(yǎng)物在不添加任何新培養(yǎng)液的情況下,分別按下列條件進行再培養(yǎng)(稱后次培養(yǎng)):1)6mL菌液在厭氧情況下再培養(yǎng)24h,計活菌數(shù)(稱后次培養(yǎng)).2)6mL菌液加入2g無營養(yǎng)的纖維素基質(zhì)中,進行固態(tài)厭氧培養(yǎng)24h,計活菌數(shù).324復(fù)旦學(xué)報(自然科學(xué)版)第39卷圖3ATCC29521生長的最適pH值Fig.3Numberofcfu/gofATCC29521inthecellulosesolidmediumwithdifferentpHvalueA.液體對照;B.加CaCO3;C.加CaCO3和pH512的緩沖液;D.加CaCO3和pH610緩沖液;E.加CaCO3和pH618緩沖液3)6mL菌液加入01073gCaCO3和2g無營養(yǎng)的纖維素基質(zhì)中,進行固態(tài)厭氧培養(yǎng)24h,計活菌數(shù).結(jié)果見表1.從表1可以看出,在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后,若仍在同一液體中繼續(xù)培養(yǎng)24h,則活菌數(shù)將迅速降低(與前次培養(yǎng)的活菌數(shù)相比降低至1/10左右);若將菌液轉(zhuǎn)移到纖維素中進行固態(tài)培養(yǎng),則在48h后活菌數(shù)幾乎不變;若將菌液轉(zhuǎn)移到加有Ca- CO3作緩沖劑的纖維素中,再經(jīng)24h后活菌數(shù)非但不減少,而且比對照提高了84倍.3討論常規(guī)的雙歧桿菌培養(yǎng)用的幾乎都是液體培養(yǎng)法.可是在我們的研究中卻發(fā)現(xiàn),用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后,由于雙歧桿菌無鞭毛,不能運動,因而菌體大多沉降在試管底部.這樣,試管底部的菌體密集,代謝產(chǎn)物濃度高,菌體生長較受抑制.這可能就是液體培養(yǎng)活菌得率較低的原因之一.在我們的實驗中,用液體培養(yǎng)時活菌數(shù)在108cfu/g的數(shù)量級上已無法再提高了,而雙歧桿菌在人體腸道內(nèi)的密度卻可達1010cfu/g的數(shù)量級[5].為此,我們模擬了類似腸道內(nèi)的固態(tài)環(huán)境,提出了雙歧桿菌固態(tài)培養(yǎng)的新方法.表1液-固態(tài)先后培養(yǎng)對ATCC29521生長量的影響Tab.1EffectofLiquid-solidcultivationongrowthofstrainATCC29521措施培養(yǎng)基成分活菌數(shù)/(107cfu#g-1)活菌數(shù)比較(倍數(shù))與24h對照比與48h對照比前次培養(yǎng)(0~24h)5mL液體培養(yǎng)基(24h對照)819110819(1)5mL液體培養(yǎng)基(48h對照)1100111110后次培養(yǎng)(24~48h)(2)5mL液體培養(yǎng)基+2g纖維素8100190810(3)5mL液體培養(yǎng)基+2g纖維素+01073gCaCO38591685從結(jié)果1可以看出,在固態(tài)培養(yǎng)基中可進行濃醪培養(yǎng).把培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物含量提高到2倍后,活菌數(shù)也比1倍營養(yǎng)物的培養(yǎng)基高出近1倍.從表1可以看出,利用/液-固先后培養(yǎng)試驗0,進一步確證了我們 認為菌體在固態(tài)培養(yǎng)基中可更充分地利用營養(yǎng)物、培養(yǎng)空間以達到高密度生長的設(shè)想.甚至,若在固態(tài)基質(zhì)(纖維素)中加入CaCO3來中和前24h培養(yǎng)所產(chǎn)的酸,可以使菌體繼續(xù)利用營養(yǎng)物質(zhì),從而導(dǎo)致活菌數(shù)增多.這說明固態(tài)培養(yǎng)確能分散或吸附菌體的代謝廢物,減少對生長的抑制.從結(jié)果3可以看出,在固態(tài)培養(yǎng)的條件下,只要控制好適當(dāng)?shù)膒H值,就能使活菌量比液體培養(yǎng)提高1014倍.從結(jié)果2可以看出,以大豆和麥麩為固態(tài)基質(zhì)的培養(yǎng)取得了良好的效果.其原因除了它們賦予培養(yǎng)基固態(tài)狀態(tài)外,還可能是為兩歧雙歧桿菌ATCC29521提供了若干生長促進物質(zhì)或其他營養(yǎng)物.本研究證實,固態(tài)培養(yǎng)較有利于雙歧桿菌的高密度生長.它不但具有很大的理論意義,還有重要的實踐價值.固態(tài)培養(yǎng)有突出的優(yōu)點:它不需要攪拌即可使菌體均勻分布,厭氧要求不高,大大簡化了培養(yǎng)裝置;若把固態(tài)基質(zhì)作為保存活菌的介質(zhì),發(fā)酵結(jié)束后只需稍許加工即可制成膠囊或添加入食品;若固態(tài)基質(zhì)本身就是一種較好的營養(yǎng)物,那就更為理想.可見,在微生態(tài)制劑開發(fā)方面,固態(tài)培養(yǎng)有著廣闊的前景.325第3期王雪奇等:兩歧雙歧桿菌固態(tài)培養(yǎng)的研究參考文獻:[1]周德慶,郭杰炎.我國微生態(tài)制劑的現(xiàn)狀和發(fā)展設(shè)想.工業(yè)微生物[J].1999,29(1):34~43.[2]CollinsCH,LynePM,GrangeJM.CollinsLyne.smicrobiologicalmethods(6thEdn)[M].London:Butter-worths,1989.74.[3]MortimerPS.TheProkaryotes:Ahandbookonhabitats,isolationandidentificationofbacteria[M].NewYork:SpringerVerlagBerlinHeidelberg,1981.1951-1959.[4]馬向前,周德慶.雙歧桿菌和乳酸菌的簡便快速計數(shù)法.微生物學(xué)報[J].1997,37(1):62~64. 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