丙型肝炎病毒準種特性的研究進展

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1、丙型肝炎病毒準種特性的研究進展　　丙型病毒性肝炎(丙肝)是一種廣泛傳播的疾病，是導(dǎo)致慢性病毒性肝炎、肝炎肝硬變、肝細胞癌(HCC)的主要病因之一，而這些病變形成與其病原丙型肝炎病毒（HCV)某些重要的生物學特性有關(guān)〔1〕。與其他RNA病毒類似，HCV基因組的易變異性可產(chǎn)生不同的型或亞型，而且在HCV感染者體內(nèi)可同時存在具有多種序列組成不同但卻有很高同源性(同源性≥95%)的HCV變異株病毒群體，即稱為HCV準種(Quasispecies)，亦有相似株和類似株之稱〔2,3〕。近年來研究表明，HCV準種株決定其某些重要的生物學特性，而且大部分學者己慣用“準種”來監(jiān)測和量化HCV在患者體

2、內(nèi)的復(fù)制及變異?，F(xiàn)就有關(guān)研究作一概述?！　?　HCV準種株特性　　1971年Eigen等〔4〕在描述地球早期生命演化時，啟用了“準種株”這一概念。以后人們在分析噬菌體Qβ群中單個病毒克隆的RNA時發(fā)現(xiàn)“準種株”的確存在，并將其引入了病毒的研究，以求循一個新途徑來解釋和說明病毒的高度變異性問題〔5〕。HCV屬于單股正連RNA病毒，其基因組包膜糖蛋白區(qū)E2/NS1基因組C端相對保守，N端含有兩個高變區(qū)域(Hypervariable13region，HVR)即HVR1(384～410/413aa)和HVR2(474～480aa)。研究發(fā)現(xiàn)HVR1含有病毒株特異的中和性抗原表位，它的變異與

3、丙肝慢性化及防治失敗密切相關(guān)〔6〕。HCV感染者體內(nèi)可同時存在大量基因序列相關(guān)的HCV準種株群體，而且會隨病情和/或病程不同而發(fā)生變化〔7，8〕。這種序列異質(zhì)性變異株可發(fā)生在HCV基因組的各區(qū)段，包括5′-非編碼區(qū)(5′-UTR)、核心區(qū)(C區(qū))、包膜區(qū)（E區(qū))及非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)(NS區(qū))等均有報道〔9-11〕。最近，Gerotto等〔12〕報道了HCV-NS5A干擾素敏感決定區(qū)(IFNSensitivity-determingregion，ISDR)準種特性，認為其會影響到HCV1b型感染者對IFN治療的應(yīng)答。但有研究證實約20%序列變異發(fā)生在E2/NS1區(qū)，HCV準種株特性在HVR

4、1表現(xiàn)較明顯而更具有代表性〔11，13，14〕?！　?　HCV準種株的量化　　隨著分子生物學技術(shù)的廣泛應(yīng)用，目前主要以準種HCV基因的復(fù)雜性(Complexity)或異質(zhì)性(Heterogeneity)程度來對其進行量化，主要有以下幾種方法:①直接測序法〔15〕。針對特定區(qū)段RNA序列進行體外逆轉(zhuǎn)錄擴增（RT-PCR)得到相應(yīng)的cDNA，然后用PCR擴增產(chǎn)物直接測序或克隆后測序，根據(jù)異質(zhì)性序列種類(diversity)來評價該區(qū)段準種株多寡。②單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法(Single-strandconformation13polymophismanalysis,SSCP)〔l6，l7〕

5、。此法是在完成靶DNA的PCR擴增之后進行單鏈DNA多態(tài)性分析的一種新方法，將單鏈擴增DNA(引物已用同位素或熒光標記)通過中性聚丙烯烯胺凝膠電泳(PAGE）和放射自顯影，根據(jù)其SSCP條帶數(shù)目及位置不同則可分辨出序列單個堿基和構(gòu)型改變，由此來判斷體內(nèi)準種株的復(fù)雜程度。③異源雙鏈泳動分析法(Heteroduplexmobilityassay,HMA/heteroduplexgelshiftanalysis，GSA),亦稱異源雙鏈示蹤檢測法（Heteroduplextrackingassay,HTA)〔10,18,19〕。此法早期主要用于艾滋病病毒異質(zhì)性研究，主要原理是基于DNA分子

6、的變性和復(fù)性過程。在DNA經(jīng)過變性后復(fù)性時，如反應(yīng)系統(tǒng)中存在兩種或兩種以上具有一定同源性的核酸分子鏈，不同來源的兩鏈同源區(qū)可配對形成雙鏈，此即異源雙鏈;異源雙鏈內(nèi)由于存在堿基錯配或不配區(qū)域，分子構(gòu)象發(fā)生了改變，不同于同源雙鏈，通過非變性的PAGE，同源性越高，泳動就越快，反之則慢。比較而言，第一種方法結(jié)果直接而可靠，但較原始且費力費時，直接PCR產(chǎn)品克隆和序列分析往往不能代表HCV準種株的真實組成，雖容易鑒別出優(yōu)勢序列，但小的克隆很可能被忽略掉。PCR-SSCP法應(yīng)用較廣，但對低于5%的準種株病毒群體亦有可能檢測不到，而且操作煩瑣〔20〕。相比之下，HMA法操作相對簡單省時，可用于

7、基因亞型的測定。這些方法學上的差異在一定程度上可能決定了各學者在研究HCV準種特性時某些結(jié)論的不一致，所以尋求一種更準確、簡便而重復(fù)性較好的方法是必需的。13　　3　HCV準種的優(yōu)勢株與劣勢株　　有研究認為〔21，22〕，對HCV準種株群體變化可能有三種解釋:①HCV變異是HCV感染人體后隨時間變化而自發(fā)產(chǎn)生的;②病情嚴重時，HCV復(fù)制更加活躍，復(fù)制期間“易錯配”(Error-prone)的RNA聚合酶導(dǎo)致了序列變異;③正性免疫選擇壓力(Positiveimmunes