丙型肝炎病毒基因疫苗研究進展

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1、丙型肝炎病毒基因疫苗研究進展丙型肝炎病毒(HCV)是輸血后肝炎的主要病原體，HCV急性感染后約50％-70%以上患者發(fā)展為慢性感染，其中部分病人可發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌。迄今為止，對HCv慢性感染尚無高效特異性治療方法，對IFN-α的治療應答率只有15％~25％[1]。因此，尋求一種預防和治療HCV感染的方法迫在眉睫?；蛞呙缬址Q為核酸疫苗或DNA疫苗，它是由病原體抗原的編碼基因和作為真核細胞表達載體的質粒所組成。這種DNA既是載體又能在真核細胞中表達抗原，刺激肌體產生特異而有效的免疫應答，可有效預防病毒

2、、細菌和寄生蟲等所引起的疾病。DNA疫苗由于具有可誘發(fā)細胞免疫和體液免疫應答、能制備抗多價疫苗、兼有預防和治療作用等優(yōu)點，且與傳統(tǒng)疫苗相比，DNA疫苗在細胞內表達的抗原具有天然構象，免疫原性良好，容易制備和運輸，所以自上世紀90年代初問世以來，已在多種疾病的防治研究中顯示出巨大的潛力[2-6]。HCVDNA疫苗是近年發(fā)展起來的新型疫苗之一，它是將HCVRNA上的某一特定片段克隆入適當?shù)谋磉_載體中再接種到體內，使目的基因得以表達，誘導機體產生特異的體液免疫和細胞免疫，以期達到預防和清除HCV感染的目的。本文

3、就HCVDNA疫苗的類型、免疫效果的影響因素、作用機制及安全性等方面的研究進展作一綜述。l不同類型HCVDNA疫苗的構建1．1HCV核心區(qū)DNA疫苗的構建對來自不同基因型的HCV分析發(fā)現(xiàn)，其核心區(qū)(C區(qū))基因片段高度保守，整個序列全長573核苷酸，編碼含191個氨基酸的核心蛋白。Tokushige等[7]將全長C區(qū)片段克隆在包含有RSV啟動子和CMV增強子的表達質粒中，構建pHCV2—2質粒，同時構建一個包括HCV5’NCR和C區(qū)全部序列的pHCV4—2質粒，用磷酸鈣沉淀法分別轉染HuH—7細胞、RD細胞

4、和G8細胞系。Westernblot分析發(fā)現(xiàn)，3個細胞系中均表達21kd的核心蛋白。且Phv2-2質粒轉染細胞的蛋白表達量明顯高于pHCV4-2。單克隆抗體檢測HCV核心蛋白為非分泌蛋白。用構建好的質粒肌肉注射BALB／C小鼠，小鼠對HCVC區(qū)蛋白體液免疫反應性較低，可能和C區(qū)蛋白非分泌有關。為了評價小鼠體內CTL活性，Tokushige還建立了表達HCV核心蛋白的同基因SP2/0骨髓瘤細胞模型。和接種pHCV4—2質粒的小鼠相比，pHCV2—2質粒免疫的小鼠存活率明顯增加、腫瘤的重量也明顯降低，這表明p

5、HCV2—2能引起較強的免疫應答。pHCV2—2質粒比pHCV4—2質粒的免疫效果為好，可能與Phcv2—2在細胞內表達的核心蛋白能誘導細胞免疫活性有關。Major等構建了表達HCVC區(qū)核蛋白前58個氨基酸的質粒DNA—PC2N，免疫Balb／c小鼠(下同)，在14同內均未出現(xiàn)抗體反應。而用該段基因與HBV的S基因，或與前S2基因構建嵌合DNA質粒，用同樣方法免疫小鼠，結果均產生抗體反應，且可持續(xù)18周[8]。Lagging等用編碼整個核殼蛋白(aa1-191)基因構建成DNA疫苗肌肉注射小鼠，均能引起血

6、清抗體、脾細胞對合成肽C7—A10的增殖反應，且能誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的殺傷活性[9]。Ceissler等認為，HCVC區(qū)核殼蛋白能誘發(fā)機體產生廣泛的體液和細胞免疫，這對清除HCV感染非常重要。在先前研究基礎上，用HCVC區(qū)和HBV的前S1、前S2、S基因構建了9種不同重組體，轉染不同細胞系，然后再免疫小鼠。結果顯示，HCVC區(qū)蛋白及不同嵌合蛋白均可在轉染細胞中表達，并可激發(fā)和增強小鼠CD4+T和CD8+T對HBV和HCV融合蛋白反應，免疫強度與CD4+T淋巴細胞產生的Th1樣細胞因子水乎有關

7、[10]。1．2HCV包膜區(qū)DNA疫苗的構建HCV包膜區(qū)(E區(qū))全長574—2427nt；分E1區(qū)(574一1149nt)和E2(1150一2427nt)，分別編碼El、E2糖蛋白，其在病毒結合靶細胞方面起重要作用。Rosa[11]通過NOB(neutralizationofbinding)定量試驗證實，HCVE2上至少存在可編碼兩種中和抗原從的基因片段，其一是位于E2區(qū)N端的高變區(qū)(highvaribleregion，HRV)，另一片段獨立于HRV以外，編碼抗原能引起不同型HCV的交叉免疫反應。Lee等

8、[12]用編碼192—364、384—719氨基酸殘基的E1區(qū)和E2片段分別和HSV—I編碼糖蛋白D的基因片段連接后克隆到pTV2質粒中，構建PTv2—SElt和pTV2-SE2t疫苗。脛前肌注射Buffalo小鼠，在小鼠體內分別產生抗體和淋巴細胞增殖反應，且pTV2-SE2t疫苗的免疫原性高于pTV2—SElt。為研究HCVE2片段不同功能區(qū)的免疫原性，Nakano等[13]將HCVE2片段分成五個功能區(qū)，即E2A(1150