丙型肝炎病毒基因疫苗研究進展

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1、丙型肝炎病毒基因疫苗研究進展丙型肝炎病毒(HCV)是輸血后肝炎的主要病原體，HCV急性感染后約50％-70%以上患者發(fā)展為慢性感染，其中部分病人可發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌。迄今為止，對HCv慢性感染尚無高效特異性治療方法，對IFN-α的治療應(yīng)答率只有15％~25％[1]。因此，尋求一種預(yù)防和治療HCV感染的方法迫在眉睫?；蛞呙缬址Q為核酸疫苗或DNA疫苗，它是由病原體抗原的編碼基因和作為真核細胞表達載體的質(zhì)粒所組成。這種DNA既是載體又能在真核細胞中表達抗原，刺激肌體產(chǎn)生特異而有效的免疫應(yīng)答，可有效預(yù)防病毒

2、、細菌和寄生蟲等所引起的疾病。DNA疫苗由于具有可誘發(fā)細胞免疫和體液免疫應(yīng)答、能制備抗多價疫苗、兼有預(yù)防和治療作用等優(yōu)點，且與傳統(tǒng)疫苗相比，DNA疫苗在細胞內(nèi)表達的抗原具有天然構(gòu)象，免疫原性良好，容易制備和運輸，所以自上世紀(jì)90年代初問世以來，已在多種疾病的防治研究中顯示出巨大的潛力[2-6]。HCVDNA疫苗是近年發(fā)展起來的新型疫苗之一，它是將HCVRNA上的某一特定片段克隆入適當(dāng)?shù)谋磉_載體中再接種到體內(nèi)，使目的基因得以表達，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異的體液免疫和細胞免疫，以期達到預(yù)防和清除HCV感染的目的。本文

3、就HCVDNA疫苗的類型、免疫效果的影響因素、作用機制及安全性等方面的研究進展作一綜述。l不同類型HCVDNA疫苗的構(gòu)建1．1HCV核心區(qū)DNA疫苗的構(gòu)建對來自不同基因型的HCV分析發(fā)現(xiàn)，其核心區(qū)(C區(qū))基因片段高度保守，整個序列全長573核苷酸，編碼含191個氨基酸的核心蛋白。Tokushige等[7]將全長C區(qū)片段克隆在包含有RSV啟動子和CMV增強子的表達質(zhì)粒中，構(gòu)建pHCV2—2質(zhì)粒，同時構(gòu)建一個包括HCV5’NCR和C區(qū)全部序列的pHCV4—2質(zhì)粒，用磷酸鈣沉淀法分別轉(zhuǎn)染HuH—7細胞、RD細胞

4、和G8細胞系。Westernblot分析發(fā)現(xiàn)，3個細胞系中均表達21kd的核心蛋白。且Phv2-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞的蛋白表達量明顯高于pHCV4-2。單克隆抗體檢測HCV核心蛋白為非分泌蛋白。用構(gòu)建好的質(zhì)粒肌肉注射BALB／C小鼠，小鼠對HCVC區(qū)蛋白體液免疫反應(yīng)性較低，可能和C區(qū)蛋白非分泌有關(guān)。為了評價小鼠體內(nèi)CTL活性，Tokushige還建立了表達HCV核心蛋白的同基因SP2/0骨髓瘤細胞模型。和接種pHCV4—2質(zhì)粒的小鼠相比，pHCV2—2質(zhì)粒免疫的小鼠存活率明顯增加、腫瘤的重量也明顯降低，這表明p

5、HCV2—2能引起較強的免疫應(yīng)答。pHCV2—2質(zhì)粒比pHCV4—2質(zhì)粒的免疫效果為好，可能與Phcv2—2在細胞內(nèi)表達的核心蛋白能誘導(dǎo)細胞免疫活性有關(guān)。Major等構(gòu)建了表達HCVC區(qū)核蛋白前58個氨基酸的質(zhì)粒DNA—PC2N，免疫Balb／c小鼠(下同)，在14同內(nèi)均未出現(xiàn)抗體反應(yīng)。而用該段基因與HBV的S基因，或與前S2基因構(gòu)建嵌合DNA質(zhì)粒，用同樣方法免疫小鼠，結(jié)果均產(chǎn)生抗體反應(yīng)，且可持續(xù)18周[8]。Lagging等用編碼整個核殼蛋白(aa1-191)基因構(gòu)建成DNA疫苗肌肉注射小鼠，均能引起血

6、清抗體、脾細胞對合成肽C7—A10的增殖反應(yīng)，且能誘導(dǎo)細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的殺傷活性[9]。Ceissler等認為，HCVC區(qū)核殼蛋白能誘發(fā)機體產(chǎn)生廣泛的體液和細胞免疫，這對清除HCV感染非常重要。在先前研究基礎(chǔ)上，用HCVC區(qū)和HBV的前S1、前S2、S基因構(gòu)建了9種不同重組體，轉(zhuǎn)染不同細胞系，然后再免疫小鼠。結(jié)果顯示，HCVC區(qū)蛋白及不同嵌合蛋白均可在轉(zhuǎn)染細胞中表達，并可激發(fā)和增強小鼠CD4+T和CD8+T對HBV和HCV融合蛋白反應(yīng)，免疫強度與CD4+T淋巴細胞產(chǎn)生的Th1樣細胞因子水乎有關(guān)

7、[10]。1．2HCV包膜區(qū)DNA疫苗的構(gòu)建HCV包膜區(qū)(E區(qū))全長574—2427nt；分E1區(qū)(574一1149nt)和E2(1150一2427nt)，分別編碼El、E2糖蛋白，其在病毒結(jié)合靶細胞方面起重要作用。Rosa[11]通過NOB(neutralizationofbinding)定量試驗證實，HCVE2上至少存在可編碼兩種中和抗原從的基因片段，其一是位于E2區(qū)N端的高變區(qū)(highvaribleregion，HRV)，另一片段獨立于HRV以外，編碼抗原能引起不同型HCV的交叉免疫反應(yīng)。Lee等

8、[12]用編碼192—364、384—719氨基酸殘基的E1區(qū)和E2片段分別和HSV—I編碼糖蛋白D的基因片段連接后克隆到pTV2質(zhì)粒中，構(gòu)建PTv2—SElt和pTV2-SE2t疫苗。脛前肌注射Buffalo小鼠，在小鼠體內(nèi)分別產(chǎn)生抗體和淋巴細胞增殖反應(yīng)，且pTV2-SE2t疫苗的免疫原性高于pTV2—SElt。為研究HCVE2片段不同功能區(qū)的免疫原性，Nakano等[13]將HCVE2片段分成五個功能區(qū)，即E2A(1150