人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及成脂成骨分化

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1、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及成脂成骨分化作者：趙磊王文加付常皓韋安慧顏煒群【摘要】目的建立小胎齡人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSCs)的分離和培養(yǎng)方法，探討hUCMSCs的成脂、成骨分化潛能。方法采用Ⅱ型膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化法從胎齡12～18w的流產(chǎn)胎兒臍帶中分離hUCMSCs;流式細(xì)胞儀檢測其免疫表型;應(yīng)用不同因子誘導(dǎo)hUCMSCs向脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞分化并進(jìn)行鑒定。結(jié)果體外培養(yǎng)的hUCMSCs呈長梭形，細(xì)胞形態(tài)均一;表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD105、CD166;不表達(dá)CD34、CD45、CD40、CD40L、CD80、CD86、HLADR;油紅O、茜素紅染色及RTPC

2、R證實(shí)hUCMSCs可分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。結(jié)論建立了小胎齡hUCMSCs分離培養(yǎng)方法，證實(shí)其具有成脂、成骨分化潛能，有望成為細(xì)胞治療及組織工程更為理想的種子細(xì)胞。【關(guān)鍵詞】臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞;免疫表型;脂肪細(xì)胞;成骨細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstem9cells,MSC)主要來源于成人骨髓，與成人骨髓MSC相比，來自于胎兒期的MSC具有更強(qiáng)大的擴(kuò)增能力、免疫原性低及來源廣泛等諸多優(yōu)勢。目前文獻(xiàn)報道的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSCs)多取材于足月生產(chǎn)的胎兒臍帶，而從人工流產(chǎn)的較小胎齡胎兒臍帶中分離的hUCMSCs未見報道。本實(shí)驗(yàn)從胎兒臍帶中分離hUCMSCs，初步研究其形

3、態(tài)學(xué)、免疫表型及分化潛能等基本生物學(xué)特性?！　?材料與方法　　1.1材料DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(Invitrogen，美國);Ⅱ型膠原酶、透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶、胰島素、1甲基3異丁基黃嘌呤、吲哚美辛、β甘油磷酸鈉、地塞米松和抗壞血酸(Sigma，美國);流式抗體(CD29FITC、CD44FITC、CD73PE、CD105PE、CD166PE、CD34FITC、CD45FITC、CD40FITC、CD40LFITC、CD80FITC、CD86PE、HLADRPE)(eBioscience，美國);RTPCR儀(StratageneMx3000p

4、)?！　?.2方法　　1.2.1hUCMSCs的分離、培養(yǎng)取自愿捐獻(xiàn)的人工流產(chǎn)胎兒尸體(胎齡12～18w)，酒精浸泡消毒，剪下臍帶，PBS沖洗，剝離臍靜脈及臍動脈。將wharton′sjelly剪成長度約5mm的組織塊，加入分離液(DMEM/F12、10%FBS、0.01%Ⅱ型膠原酶、0.05%透明質(zhì)酸酶)，在37℃、5%CO2和95%空氣的條件下消化過夜。1500r/min離心10min,用含10%FBS的DMEM/F12懸浮細(xì)胞，以5×103個細(xì)胞/cm2的密度接種。489h后首次換液，吸棄未貼壁細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長至占培養(yǎng)皿底面積80%時，用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化

5、液消化，按1∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。　　1.2.2細(xì)胞免疫表型測定取第3代hUCMSCs，制成單細(xì)胞懸液。分別加入抗人CD29、CD44、CD73、CD105、CD166、CD34、CD45、CD40、CD40L、CD80、CD86、HLADR單克隆抗體，4℃孵育30min,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型分子陽性率。　　1.2.3hUCMSCs成脂誘導(dǎo)分化①誘導(dǎo)過程：第3代細(xì)胞生長至占培養(yǎng)皿底面積80%時，將基礎(chǔ)培養(yǎng)液更換為成脂誘導(dǎo)液(DMEM/F12、10%FBS、1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L1甲基3異丁基黃嘌呤、100mmol/L吲哚美辛、10mg/L胰島素)，每3d換液

6、。②油紅O染色：成脂誘導(dǎo)第14天，吸棄誘導(dǎo)培養(yǎng)液，PBS沖洗，4%多聚甲醛室溫固定1h，70%異丙醇清洗，油紅O工作液室溫染色10min，70%異丙醇洗去多余染料。③RTPCR檢測：Trizol法提取空白組及誘導(dǎo)組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，進(jìn)行RTPCR相對定量實(shí)驗(yàn)。檢測脂肪誘導(dǎo)分化過程中的特異性蛋白PPARγ在0、7、14、28d表達(dá)量的變化。PPARγ特異性引物(正向：CGAAGACATTCCATTCACAAG，反向：CTCCACAGACACGACATTC)，GAPDH作為內(nèi)參照(正向引物：GACAGTCAGCCGCATCTTC，反向引物：ACTCCGACCTTCAC

7、CTTCC)。反應(yīng)條件95℃，30s;58℃，60s;72℃，60s。40個循環(huán)。9　　1.2.4hUCMSCs成骨誘導(dǎo)分化①誘導(dǎo)過程：第3代生長至占培養(yǎng)皿底面積60%時將基礎(chǔ)培養(yǎng)液更換為成骨誘導(dǎo)液(DMEMLG、10%FBS、50μg/ml抗壞血酸、10mmol/Lβ甘油磷酸鈉、108mol/L地塞米松)。每3d換液。②茜素紅染色：成骨誘導(dǎo)至第14天，吸棄誘導(dǎo)培養(yǎng)液，PBS沖洗，95%乙醇室溫固定10min，雙蒸