冠心病痰瘀證候與載脂蛋白e基因多態(tài)性相關性的研究

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冠心病痰瘀證候與載脂蛋白E基因多態(tài)性相關性的研究作者：莫鴻輝,潘佩光,黃衍壽,洪永敦,王艷紅【摘要】【目的】探討冠心病(CHD)痰瘀證候與載脂蛋白E(ApoE)血清水平及其基因多態(tài)性的關系。【方法】選擇符合中醫(yī)痰瘀證型的CHD患者(CHD組)97例,其中又分為痰證組30例、瘀證組32例、痰瘀證組35例。另選擇健康人群35例設為正常對照組。檢測所有樣本的ApoE血清水平,提取全血DNA,用聚合酶鏈反應—限制性片段長度多態(tài)性(PCRRFLP)技術檢測ApoE基因型,采用SPSS110軟件進行相關性分析?！窘Y果】傳統(tǒng)危險因素中糖尿病、吸煙、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)和高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)等指標CHD組明顯高于正常對照組(P<005)。CHD組及組內各型的ApoE血清水平均高于正常對照組(P<001)。CHD組內各證型間比較,痰瘀證ApoE血清水平明顯高于痰證和瘀證(P<001),瘀證ApoE血清水平也高于痰證(P<005)。CHD組E3/3基因型頻率低于正常對照組(P<005),而E3/4基因型頻率明顯高于正常對照組(P<001)。CHD組E4等位基因頻率高于正常對照組(P<005)。痰證的E3/4基因型和E4等位基因頻率高于痰瘀證、瘀證(P<005),而E3/3基因型及E3等位基因在痰證中的頻率低于痰瘀證及瘀證(P<005)?！窘Y論】ApoE可能是CHD獨立預測因子之一,其血清水平升高與CHD痰瘀證關系密切。ApoE15 E4等位基因和CHD密切相關,其中E3/4基因型可能是CHD及其痰證的主要易感基因之一。【關鍵詞】冠狀動脈疾病;載脂蛋白E;基因多態(tài)性;痰瘀證　冠心病(CHD)是威脅人類健康的重要疾病。既往研究識別了多種冠心病危險因素,但仍有約50%的CHD患者不能以已知危險因素解釋[1],因而進一步深入探討其病因勢在必行。目前,CHD病因研究主要集中在兩個方面：繼續(xù)從宏觀水平尋找危險因素及從微觀水平探討CHD發(fā)病的遺傳易感機理?！　‰S著分子生物學理論和技術的發(fā)展,CHD基因機制的研究也日益受到重視,CHD是一種復雜的多基因遺傳病這一觀點也日益為人們所接受,這將為從分子水平上治療CHD開辟新的途徑。載脂蛋白E(ApoE)是一種多功能蛋白,是膽固醇和脂蛋白代謝的關鍵調節(jié)蛋白之一[2],與CHD的關系密切,其功能與結構和基因表達密切相關,因此,研究ApoE基因多態(tài)性與CHD的相關性已成為熱點[3-4]。本研究通過觀測CHD患者與健康人之間、CHD患者痰瘀各證型之間ApoE血清水平及其基因多態(tài)性的異同,以期能進一步揭開中國人ApoE基因多態(tài)性與CHD關系,指導CHD中醫(yī)臨床診治?，F(xiàn)將結果報道如下?！　?研究對象與方法15 　　11研究對象觀察病例均為2006年1月～2007年6月廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心內科收治的CHD患者(CHD組),均符合中醫(yī)痰瘀證型的辨證標準,共97例,其中男58例,女39例;平均年齡(6297±1261)歲。97例痰瘀證型CHD患者又分為痰證組(30例)、瘀證組(32例)、痰瘀證組(35例)。另選擇同期醫(yī)院門診體檢且與CHD組年齡、性別相匹配的健康者35例(設為正常對照組),其中男18例,女17例;平均年齡(6651±1264)歲。CHD組和正常對照組均為無血緣關系的中國廣東地區(qū)漢族人,2組性別、年齡等基本資料比較,差異無顯著性意義(P>005),具有可比性。　　12診斷標準CHD診斷按國際心臟病學會和協(xié)會及世界衛(wèi)生組織臨床命名標準化聯(lián)合專題組制定的《缺血性心臟病命名和診斷標準》[5]。中醫(yī)診斷參照《中醫(yī)病證診斷療效標準》[6]中胸痹心痛的辨證標準。排除標準：感染性疾病及非感染性炎癥疾病患者;嚴重心力衰竭,美國紐約心臟病協(xié)會心功能3級或以上患者;嚴重肝功能不全(谷丙轉氨酶達正常上限2倍以上);嚴重腎功能不全需透析者;腫瘤患者;造血系統(tǒng)疾病患者?！　?3觀察指標觀察CHD組與正常對照組的基線資料,各組ApoE血清水平,ApoE基因型與等位基因頻率在CHD不同中醫(yī)證型中的分布情況。15 　　131CHD組與對照組基線資料比較兩組的性別、年齡、吸煙、飲酒、家族史、合并癥、體質量指數(shù)(BMI)及血脂水平?！　?32標本收集與模板DNA制備研究對象入院后次日凌晨6時進行采血，采集其空腹非抗凝外周靜脈血3mL,標本置于-70℃冰箱保存。使用試劑：DNA分子標準DL2000Marker(大連寶生物公司產品),QIAampDNABloodMiniKit(Qiagen公司產品),TaqDNAPolymerase、dNTPs(均為北京索奧公司產品)。外周血白細胞DNA的提取具體步驟(操作方法按照試劑的說明書進行)：取15mL離心管,注明名字;管底加蛋白酶K(ProteaseK)20μL,全血200μL,BufferAL200μl,混勻后56℃水浴10min;取無水乙醇200μL加入管中,混勻,轉移入SpinColumn,8000r/min離心5min;棄濾液,用SpinColumn轉移入清潔收集管中,加濃縮洗滌緩沖液1(AW1)500μL,8000r/min離心5min;棄濾液,用SpinColumn轉移入另一清潔管中,加濃縮洗滌緩沖液2(AW2)500μL,8000r/min離心5min;棄濾液,用SpinColumn轉移入已標名字的15mL離心管中,加BufferAE或蒸餾水200μL,8000r/min離心5min;-20℃保存?zhèn)溆谩！　?33聚合酶鏈反應——限制性片段長度多態(tài)性(PCRRFLP)檢測和基因定型采用PCRRFLP方法鑒定ApoE基因的基因型。PCR引物序列為5’AACAACTGACCCCGGTGGCG3’(正義鏈),5’ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC3’(反義鏈)。反應總體積為50μ15 L,其中包括：10倍PCRBuffer5μL,10mmoldNTPs1μL,上下游引物各10pmol(2μL),Taq酶3U(15μL),模板5μL,不足體積用滅菌去離子水加至50μL。混勻后離心,加無菌石蠟油覆蓋液面,置于PE9700PCR擴增儀。反應條件：93℃熱啟動10min,93℃3min預變性,55℃退火溫度,共35個循環(huán),72℃延伸10min。擴增產物用限制性內切酶HhaI(MBI公司產品)37℃酶切2h后,取10μL酶切產物用20g/L的瓊脂糖凝膠進行電泳。根據(jù)消化片段大小即可檢出ApoE基因的6種基因型,分別如下：(1)E2/2：91bp、83bp;(2)E2/3：91bp、83bp、48bp、35bp;(3)E3/3：91bp、48bp、35bp;(4)E2/4：91bp、83bp、72bp、48bp、35bp;(5)E3/4：91bp、72bp、48bp、35bp;(6)E4/4：72bp、48bp、35bp。圖1中可見E2/3、E3/3及E3/4基因型?！　?、3:E2/3;2:E3/4;4、5、6、7:E3/3　　圖1ApoE基因型圖譜　　Figure1Agarosegelelectrophoregram　　ofApoEgenotypes　　134血清ApoE水平測定采集研究對象入院后次日凌晨6時的空腹非抗凝外周靜脈血2mL,3500r/min離心1515 min,分離血清,-20℃保存;以及收集細胞培養(yǎng)后上清液,-20℃保存,應用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(ELISA法)測定ApoE含量。酶聯(lián)板內、板間變異系數(shù)均<10%?！　?4統(tǒng)計學方法應用SPSS110統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析?；蛐秃偷任换蝾l率采用頻率計數(shù)法計算,研究對象基因型與HardyWeinberg平衡定律的符合程度、組間基因型與等位基因頻率的比較均采用卡方檢驗,不同等位基因間臨床和生化特征的比較采用t檢驗或卡方檢驗,比值比(oddsratio,OR)、交互作用采用Logistic回歸分析,相關性檢驗采用秩相關回歸分析。檢驗水平α=005?！　?結果　　21CHD組與正常對照組基線資料比較表1結果表明：傳統(tǒng)危險因素中糖尿病、吸煙、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)和高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)等指標CHD組高于正常對照組(P<005),但高血壓病史、體質量指數(shù)(BMI)以及性別、年齡、飲酒、家族史等方面2組比較差異均無顯著性意義(P>005)?！　?2CHD組內痰證、瘀證及痰瘀證患者基線資料比較表2結果表明：CHD組內痰證、瘀證及痰瘀證患者基線資料比較,性別、年齡、糖尿病、吸煙、LDLC、HDL15 C、高血壓病史和BMI等各項指標差異均無顯著性意義(P>005)。表1CHD組與正常對照組基線資料比較表2CHD組內痰證、瘀證及痰瘀證基線資料比較　　23各組間ApoE血清水平比較表3結果顯示：CHD組以及組內各型的ApoE血清水平均高于正常對照組(P<001),但CHD組內各證型間比較,痰瘀證ApoE血清水平明顯高于痰證和瘀證(P<001),瘀證ApoE血清水平也高于痰證(P<005)。表3各組間ApoE血清水平比較(±s)　　24ApoE基因多態(tài)性與CHD的關系2組共觀察到6種基因型及3種等位基因,分別是E3/3型、E3/4型、E2/3型、E2/4型、E4/4型、E2/2型和E2、E3、E4。正常對照組中,E3/3型、E3/4型、E2/3型、E2/4型、E4/4型、E2/2型頻率分別為690%、115%、171%、29%、0%、0%。而在CHD組中,E3/3型、E3/4型、E2/3型、E2/4型、E4/4型、E2/2型頻率分別為526%、312%、140%、11%、11%、0%。兩組均未見E2/2基因型。經檢驗,各等位基因頻率符合HardyWeinberg遺傳平衡定律,表明各等位基因已達到遺傳平衡,具有群體代表性。由于E2/2基因型分布頻率少于1%,因此在分組統(tǒng)計時將其忽略?！　HD組和正常對照組ApoE基因型和等位基因頻率的分布比較見表4。CHD組E3/3基因型頻率明顯低于正常對照組(P<015 05),而E3/4基因型頻率明顯高于正常對照組(P<001),E2/3在兩組間差異無顯著性意義(P>005)。CHD組E4等位基因頻率明顯高于正常對照組(P<005),OR值為4065,95%CI分別為0996～7126,表明E4等位基因變異與CHD發(fā)病顯著相關。而E3、E2等位基因在兩組間差異無顯著性意義(P>005)?！　?5ApoE基因型與等位基因頻率在CHD不同中醫(yī)證型中的分布比較表5結果顯示：帶有E3/4基因型和E4等位基因的CHD患者數(shù)在痰瘀證、瘀證中明顯低于痰證(P<005),而帶有E3/3基因型及E3等位基因在痰瘀證及瘀證中的頻率則明顯高于痰證(P<005)。表4CHD組和正常對照組ApoE基因型和等位基因頻率的分布比較表5ApoE基因型與等位基因頻率在CHD患者不同中醫(yī)證型中的分布比較　　3討論　　31ApoE血清水平與CHD及其證型關系在眾多發(fā)病因素中,高脂血癥尤其是高膽固醇血癥與CHD關系最密切。ApoE主要由肝臟、腦組織合成,是膽固醇和脂蛋白代謝的關鍵調節(jié)蛋白之一,與高脂血癥及CHD關系密切[2]。動物實驗發(fā)現(xiàn)[7]缺乏ApoE的大鼠有自發(fā)性的總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平升高和HDL15 C水平的下降,并有粥樣斑塊形成的典型改變。Wilson等[8]的研究顯示ApoE可能導致個體間血脂水平的差異,并可能與高脂血癥和冠心病發(fā)生有關。本研究結果顯示CHD組與正常對照組間的ApoE血清水平的差異有顯著性意義(P<001),提示ApoE血清水平升高與CHD發(fā)病有關,ApoE可能是CHD獨立預測因子之一,與既往報道相符?！　≈嗅t(yī)學認為,CHD所表現(xiàn)的“胸痹”、“心痛”、“怔忡”等病癥,主要是因年老臟衰、飲食不當、勞逸失度及外邪內侵等引起。由以上諸因素所產生的多種病理產物如痰濁、水飲、瘀血等,導致了心脈痹阻和胸痹心痛。以往的證候調查已證實,CHD病變程度嚴重的患者以痰濁證和血瘀證為多見。痰濁血瘀是CHD的重要病機已成為共識[9],且痰濁血瘀與脂質代謝紊亂密切相關。本研究結果顯示,CHD血瘀組(瘀證組)及痰瘀互結組(痰瘀證組)ApoE血清水平較痰濁組(痰證組)增高(P<005),考慮與ApoE介導的脂質代謝異常在CHD血瘀組及痰瘀互結組患者中表現(xiàn)更為顯著有關?！　?2ApoE基因多態(tài)性與CHD發(fā)病的關系　　3215 1廣東省漢族人群ApoE基因多態(tài)性的分布人類ApoE有3種主要的異構體(E2、E3和E4),其間的差異僅在于112位和158位上的單個氨基酸不同。E2的112位和158位均為半胱氨酸(Cys),E3的112位是精氨酸(Arg)，158位是Cys,而E4的112位和158位均為Arg。這種因單個氨基酸不同造成的異構體是由ApoE基因多態(tài)性決定的。在人群中3種不同的ApoE等位基因分布頻率不同,因而決定了不同人群中ApoE表型的頻率差異[10-15]。本研究通過PCRRFLP法分析了35例廣東地區(qū)健康成人ApoE基因多態(tài)性分布,發(fā)現(xiàn)此類人群中ApoE基因多態(tài)性分布符合HardyWeinberg遺傳平衡定律,達到遺傳平衡,具有群體代表性,可以代表廣東地區(qū)漢族人群,提示了本研究的可靠性?！　?22ApoE基因多態(tài)性與冠心病的關系ApoE基因中E4等位基因的頻率在各國人群中有很大差異,而CHD的發(fā)病率也有很大差異。芬蘭CHD發(fā)病率居世界首位,其人群中E4等位基因頻率也最高,達227%[9]。亞洲人群發(fā)病率相對較低,E4等位基因頻率也低[13,16-17]。E4等位基因頻率較高的患者中，TC、LDLC水平也較高,而TC、LDLC均是CHD的易患因素,提示E4等位基因與CHD存在一定的相關關系。如馬洪盛等[18]隨機選擇濰坊地區(qū)漢族人88例CHD患者與75例健康成人,研究ApoE基因多態(tài)性與CHD的相關性,結果表明ApoE基因多態(tài)性與血脂代謝及CHD的發(fā)生密切相關。E4等位基因是CHD發(fā)病的遺傳易感因子,E2等位基因是預防CHD發(fā)生的保護因子,認為ApoE基因多態(tài)性可能通過影響ApoE水平而實現(xiàn)CHD致病作用。楊麗霞等[19]的研究也顯示ApoEE4等位基因可能是冠心病的遺傳易感因子。王學銘等[20]研究表明ApoEE3/4基因型頻率升高是CHD發(fā)病的重要危險因素。潘家華等[21]的研究表明E4等位基因是影響血清TC、LDLC水平的重要遺傳因素之一,并可進一步導致冠狀動脈粥樣硬化及CHD的發(fā)生,是CHD發(fā)病的重要危險因素。15 　　本研究在此基礎上,通過分析97例CHD患者及35例健康對照者與ApoE基因多態(tài)性關系,發(fā)現(xiàn)E4等位基因和CHD密切相關,與其他基因型比較,E4等位基因攜帶者患CHD的風險較其他等位基因高,提示ApoE基因多態(tài)性與廣東漢族人CHD關系密切,而E4等位基因可能是CHD發(fā)病的遺傳易感基因?！　?3ApoE各基因型及等位基因分布與冠心病證型關系如上所述,ApoEE4等位基因的攜帶者更易于發(fā)生脂質代謝紊亂,與此基因多態(tài)性相關的各種疾病如冠心病、老年癡呆、高血壓、糖尿病等,均與中醫(yī)學的痰瘀有關。因此,對ApoE基因多態(tài)性與痰瘀證候的關系進行研究,有利于認識痰瘀證候的病因病機。本研究結果表明：ApoE等位基因E4攜帶者更傾向于發(fā)生痰證,表明E4等位基因,特別是E3/4基因型可能是CHD及其痰證的主要易感基因之一。　　本研究初步顯示：ApoE血清水平升高與CHD痰瘀互結證關系密切,ApoE基因多態(tài)性與廣東漢族人CHD關系密切,E4等位基因可能是CHD發(fā)病的遺傳易感基因。因此,通過檢測ApoE血清水平及其基因型,對CHD的早期發(fā)現(xiàn)、早期預防意義重大,同時也有助于指導CHD中醫(yī)臨床診治?！緟⒖嘉墨I】15 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