資源描述：
《大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣的fura-2熒光測(cè)定》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣的Fura-2熒光測(cè)定【關(guān)鍵詞】大鼠心肌細(xì)胞Fura-2的化學(xué)名為2-［6-雙乙酸基-5-(2-雙乙酸氨基)-5-甲苯氧乙氧基］-2-苯駢呋喃基-5-惡唑羧酸五鉀鹽。屬于第二代熒光指示劑，是測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離鈣的重要試劑［1］。用Ca2+熒光指示劑Fura-2檢測(cè)活細(xì)胞胞漿中［Ca2+］i是十幾年來(lái)興起的一門技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生理、病理的研究，已有文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用于測(cè)定細(xì)胞［2］、組織塊［3］等內(nèi)的游離鈣。應(yīng)用本院的970CRT熒光分光光度計(jì)，根據(jù)本院的實(shí)驗(yàn)條件，本研究建立了用Fura-2雙波長(zhǎng)
2、熒光法測(cè)定心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣的方法。1材料與方法1.1儀器與試劑970CRT熒光分光光度計(jì)（上海分析儀器總廠），IGO150型CO2培養(yǎng)箱（Thermoelectroncorporation），601超級(jí)恒溫水浴孵箱（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠），TDZ5-WS小型離心機(jī)（北京光學(xué)儀器廠）。Fura-2/AM、DMEM、1∶250胰蛋白酶購(gòu)于SIGMA公司；TritonX-100、EDTA購(gòu)于上海華美；小牛血清購(gòu)于北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。61.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1實(shí)驗(yàn)原理Fura-2具有較
3、強(qiáng)的親水性，不易透過(guò)細(xì)胞膜，但能與Ca2+特異性結(jié)合，在特定波長(zhǎng)的紫外光激發(fā)下產(chǎn)生熒光，乙酰羧基甲基酯（Acetoxy-Methylester，AM）具有親酯性，可透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。細(xì)胞質(zhì)中的酯酶可將Fura-2/AM水解為游離的Fura-2，F(xiàn)ura-2與細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+結(jié)合形成Fura-2-Ca2+復(fù)合物，F(xiàn)ura-2及其與Ca2+結(jié)合的復(fù)合物其最大激發(fā)波長(zhǎng)分別為380nm和340nm，其發(fā)射光的強(qiáng)度與Ca2+濃度呈比例，胞漿Ca2+濃度愈高，F(xiàn)ura-2與Ca2+形成的螯合物愈多，在340nm激發(fā)波
4、長(zhǎng)處產(chǎn)生的熒光（F340）愈強(qiáng)，而在380nm激發(fā)波長(zhǎng)處產(chǎn)生的熒光（F380）愈弱，因此F340/F380可以反映胞漿Ca2+濃度。1.2.2心肌細(xì)胞懸液的制備取出生2～3天的SD大鼠，開胸取出心臟，用Hanks液洗滌3次后，剪成1mm3的小塊，放入50mL三角燒瓶，加入0.08%胰蛋白酶消化液5mL，在磁力攪拌器上（35～37℃6）進(jìn)行消化，10min后取下吹打混勻后靜置，吸棄上清，再加入5mL胰蛋白酶消化液，同樣溫度消化5～8min后取下靜置，收集上清于離心管，并向管中加入少量DMEM培養(yǎng)基及小牛血清終止消
5、化。重復(fù)以上過(guò)程4～6次，直至將組織塊消化，細(xì)胞分離完全，以128g離心8～10min，吸棄上清液，加入15%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含慶大霉素4萬(wàn)U/L）混懸沉淀的細(xì)胞，以200鉬鋼網(wǎng)過(guò)濾后置入CO2培養(yǎng)箱，37℃靜置培養(yǎng)1.5～2h，以差速貼壁法純化心肌細(xì)胞。將細(xì)胞密度調(diào)至2×106個(gè)/mL，0.4%臺(tái)盼蘭染色，活細(xì)胞比率大于90%，接種于含無(wú)菌載玻片的24孔培養(yǎng)板中，送入通以5%CO2的CO2孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24～36h。1.2.3Fura-2/AM的負(fù)載去除長(zhǎng)有心肌細(xì)胞的載玻片孔內(nèi)的培養(yǎng)基，加入0.2
6、5%Fura-2/AM使其終濃度為5μmol/L，含0.2%小牛血清的培養(yǎng)基200μl，CO2孵育箱中37℃孵育40min，負(fù)載完畢后，將細(xì)胞用胰酶消化下來(lái)，離心10min（100g/min），去上清，用Hanks液沖洗2～3次，除去細(xì)胞外的Fura-2/AM，重新懸浮成1×106個(gè)/mL細(xì)胞濃度待用。1.2.4測(cè)定細(xì)胞懸液的熒光6熒光測(cè)定采用970CRT熒光分光光度計(jì)，測(cè)定條件：激發(fā)狹縫與發(fā)射狹縫均為10nm，靈敏度為2，掃描速度為最快。（1）先掃描測(cè)定fura-2/AM標(biāo)準(zhǔn)液、負(fù)載液及測(cè)定細(xì)胞內(nèi)fura-2
7、的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，fura-2/AM無(wú)Ca2+結(jié)合能力，其激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)在加入Ca2+前后變化不大，最大發(fā)射波長(zhǎng)為490nm，最大激發(fā)波長(zhǎng)為380nm，負(fù)載液的熒光光譜基本上同于此。Fura-2與細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+結(jié)合形成Fura-2-Ca2+復(fù)合物，最大激發(fā)波長(zhǎng)從380nm漂移到340nm。固定發(fā)射波長(zhǎng)490nm，測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)340/380nm的熒光值。（2）加入10%TritonX-100，使終濃度為0.1%，破壞細(xì)胞膜，半小時(shí)后上機(jī)檢測(cè)最大值，檢測(cè)340nm、380nm兩個(gè)波長(zhǎng)處的值。（3）加入
8、EDTA，使終濃度為5mmol/L，絡(luò)合所有的鈣離子，使fura-2呈游離狀態(tài)，半小時(shí)后上機(jī)檢測(cè)最小值，檢測(cè)340nm、380nm兩個(gè)波長(zhǎng)處的值。1.2.5鈣離子濃度的計(jì)算上面測(cè)得的是相對(duì)值，由下列公式計(jì)算［Ca2+］i，［Ca2+］i=Kd（FD/FS）×（R-Rmin/Rmax-R）。式中R是實(shí)驗(yàn)觀察到的熒光比值（F340/F380）,Kd是fura-2與Ca2+反應(yīng)的解離常數(shù)，生
