icu分離銅綠假單胞菌耐藥性分析

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ICU分離銅綠假單胞菌耐藥性分析作者：陳燕青趙仲農(nóng)錢小　銅綠假單胞菌是臨床最常見的條件致病菌之一,已對臨床感染的控制構(gòu)成嚴(yán)重威脅［１～３］?，F(xiàn)就本院ICU近三年來分離的銅綠假單胞菌耐藥性進(jìn)行研究分析?！　?資料與方法　　1.1菌株　　收集2002年6月至2005年6月ICU住院患者分離的銅綠假單胞菌67株，細(xì)菌來源包括痰液58株，咽拭子7株，留置導(dǎo)尿2株。　　1.2主要試劑　　2-巰基丙酸（2-MPA）購自Sigma公司?？咕幖埰喊逼S西林/舒巴坦，替卡西林，替卡西林/克拉維酸，哌拉西林，哌拉西林/他唑巴坦，頭孢哌酮，頭孢哌酮/舒巴坦，頭孢吡肟，頭孢他啶，阿米卡星，環(huán)丙沙星和復(fù)方新諾明，均為英國Oxoid公司產(chǎn)品。　　1.3方法6 　　采用Kirby-Bauer瓊脂擴(kuò)散法，結(jié)果按NCCL2005年版判斷［４］。質(zhì)控菌株為銅綠假單細(xì)胞ATCC27853。　　1.4金屬β內(nèi)酰胺酶（金屬酶）測定　　采用2-巰基丙酸（2-MPA）協(xié)同試驗(yàn)方法［５］，在預(yù)告已涂布待檢菌MH平板上分別貼上2-MPA紙片和頭孢他啶紙片，兩紙片中心間距30mm，過夜培養(yǎng)后觀察結(jié)果，凡頭孢他啶片抑菌環(huán)擴(kuò)大者即判為產(chǎn)金屬酶陽性?！　?.5金屬酶和外膜蛋白分析　　用PCR方法分別檢測金屬酶IMP型和VIM型和外膜蛋白D2（oprD2）。靶基因引物序列（5'→3'）IMP型為CTACCGCAGCAGAGTCTTTC和AACCGTTTTGCCTTACCAT；VIM型為ATTCCGGTCGG（A/G）GAGGTCCG和GAGCAAGTCTAGACCGCCCG；oprD2為GCGCATCTCCAAGACCATG和GCCACGCCATTTGACGGAG。堿裂解法提取DNA模析，按說明書設(shè)置各PCR反應(yīng)體系和熱循環(huán)參數(shù)，PCR擴(kuò)增儀為PE9600型。擴(kuò)增產(chǎn)物作2%瓊脂糖凝膠電泳，PCR檢測陽性對照DNA(以上試劑盒及對照物均由無錫克隆遺傳所提供)。6 　　2結(jié)果　　2.1金屬酶檢出結(jié)果　　檢出產(chǎn)金屬酶菌28株（41.8%），分別為痰液25株，咽拭子3株?；驒z測23例陽性，其中IMP型17株，VIM型6株，型別不明5株。檢測有32株缺失?！　?.2藥敏試驗(yàn)結(jié)果　　見表1。表167株銅綠假單胞菌對13種抗生素耐藥率（略）　　3討論銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制主要有外膜蛋白D2丟失和產(chǎn)生β內(nèi)酰胺酶，其中產(chǎn)生金屬酶可導(dǎo)致幾乎對所有的β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，且酶抑制劑的抑制作用很弱［６］。本研究結(jié)果，在67株細(xì)胞中用2-MPA協(xié)同試驗(yàn)有28株為產(chǎn)金屬酶株；基因檢測有23株陽性，目前已知的金屬酶基因型有IMP、VIM、L1、OXA、GES、2TFFU等［７］，是否還有其它基因型別尚有待研究。值得關(guān)注的是2003年和2004年的菌株基因型以IMP為主，隨后演變?yōu)橐訴IM為主，總共有32株細(xì)菌證明蛋白D26 缺失，其中產(chǎn)金屬酶的菌株均為缺失，表明外膜通道不暢也是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的主要原因之一。近年來，銅綠假單胞菌對β內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥率已有上升趨勢，尤其是產(chǎn)金屬酶的菌株。對13種常用藥物的檢測結(jié)果表明，產(chǎn)金屬酶菌株除對替卡西林、亞胺培南全部耐藥外，對氨芐西林/舒巴坦、復(fù)方新諾明、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢哌酮、替卡西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦和環(huán)丙沙星的耐藥率也在50%～93%之間。耐藥率＜50%的僅有阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦和頭孢吡肟，與文獻(xiàn)相近［１，２，８］。按照對亞胺培南、頭孢他啶、哌拉西林、環(huán)丙沙星等均耐藥的銅綠假單胞菌定義為多藥耐藥銅綠假單胞菌（MDRP）［９］，28株產(chǎn)金屬酶菌株大多還對復(fù)方新諾明和環(huán)丙沙星耐藥，屬于MDRP。對于產(chǎn)金屬酶細(xì)菌的治療，目前尚無應(yīng)用于臨床的金屬酶抑制劑，氨曲南不被金屬酶所水解，但臨床應(yīng)用的效果并不理想，頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦顯示有較好的敏感性，必要時(shí)，可與氨基糖苷類或氟諾酮類聯(lián)合使用。【參考文獻(xiàn)】　　1周立新,張秀平,方濱,等.重癥監(jiān)護(hù)病房感染患者銅綠假單胞菌的分離與耐藥性分析.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2004,14(7):807～808.　　2王輝,陳民鈞.1994～2001年中國重癥監(jiān)護(hù)病房非發(fā)酵糖細(xì)菌的耐藥變遷.中華醫(yī)學(xué)雜志,2003,83(5):385～390.6 　　3蔣曉飛,洪秀華,孫景勇,等.多重耐藥銅綠假單胞菌超廣譜β內(nèi)酰胺酶分析.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2002,22(6):443～446.　　4Nccls.Perfomationsandardsofantimicrobialsusceptibilitytesting:Fifteenthinformationalsupplement.M100-S15.NationalCommitteeforClinicalLaboratryStandards,2005,25(1):40～42.　　5錢小毛，毛中萍，趙仲農(nóng)，等.2-巰基丙酸協(xié)同試驗(yàn)檢測細(xì)菌金屬β內(nèi)酰胺.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2004,27(2):126.　　6趙青,魏澤慶,俞云松,等.重癥監(jiān)護(hù)病房產(chǎn)VIM-2型金屬酶銅綠膿假單胞菌的研究.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2004,27(10):678～682.　　7糜祖煌.金屬β內(nèi)酰胺酸基因及其檢測方法.現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué),2004,16(1):15～16.　　8辜依海,羅燕萍,張文莉,等.耐亞胺培南銅綠假單胞菌的耐藥性分析及金屬內(nèi)酰胺酶檢測.中華醫(yī)學(xué)感染學(xué)雜志,2005,15(3):339～341.6 　　9王輝;陳民鈞.非發(fā)酵革蘭陰性桿菌的耐藥發(fā)展研究進(jìn)展.中國抗生素雜志,2004,29(3):193～195.毛6