stat3survivin途徑介導(dǎo)槲皮素調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖和凋亡

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1、STAT3SURVIVIN途徑介導(dǎo)槲皮素調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖和凋亡【摘要】目的:觀察STAT3SURVIVIN途徑在槲皮素調(diào)控胃癌細(xì)胞SGC7901增殖和凋亡中的作用.方法:不同濃度的槲皮素及陽性對照組(AG49040μmol/L)作用細(xì)胞后,MTT法檢測細(xì)胞毒作用;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡;RealtimeRTPCR,WesternBlotting檢測stat3，survivin基因mRNA及蛋白的表達(dá).結(jié)果:隨作用時(shí)間延長和濃度增高，槲皮素對SGC7901細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng).48h槲皮素40μmol/L組與陽性對照組凋亡率相近.Stat3，survivinmRNA之

2、間呈直線相關(guān)關(guān)系(r=0.697，P=0.002)，且pstat3和survivin蛋白也呈直線相關(guān)關(guān)系(r=0.748，P=0.003).結(jié)論:槲皮素可能通過調(diào)控STAT3SURVIVIN途徑抑制胃癌SGC7901細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡.【關(guān)鍵詞】stat3基因survivin基因槲皮素胃腫瘤細(xì)胞增殖細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路　　0引言　　槲皮素(quercetin,Que,3,3′,4′,5′,72五羥基黃酮)又稱槲皮酮,為中藥槲樹皮的主要提取成分,具有廣泛的藥理活性，如抗炎、抗腫瘤等.Stat3，survivin是繼bcl2之后相繼發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)重要的凋亡抑制基因.9大量體內(nèi)

3、外研究表明抑制這兩種基因的表達(dá)或功能可以抑制腫瘤細(xì)胞生長,促進(jìn)凋亡［1-2］.黃酮類抗腫瘤藥槲皮素是否通過抑制STAT3SURVIVIN途徑促使腫瘤細(xì)胞調(diào)亡，目前尚屬未知.我們施用槲皮素于胃癌SGC7901細(xì)胞,觀察STAT3SURVIVIN途徑在槲皮素調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖和凋亡中的作用.　　1材料和方法　　1.1材料人中分化胃癌細(xì)胞株SGC7901,由蘭州大學(xué)分子生物學(xué)教研室提供;干粉型RPMI1640,槲皮素,DMSO,AG490購自Sigma公司;胎牛血清購自杭州四季青公司;MTT購自Inventrogen公司;總RNA柱式提取試劑盒購自BBI公司;RealTime

4、PCR試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司.Stat3上游引物:5′CCAGTCAGTGACCAGGCAGAAG3′,下游引物:5′GCACGTACTCCATCGCTGACA3′,擴(kuò)增產(chǎn)物114bp；survivin上游引物:5′AGGTCATCTCGGCTGTTCCTG3′,下游引物:5′TCATCCTCACTGCGGCTGTC3′,擴(kuò)增產(chǎn)物127bp;內(nèi)參照GAPDH上游引物:5′GTGCTTTGACAAATCCCATCTGA3′,下游引物:5′GTTACTGTCCCGGATCTTGTCCA3′,擴(kuò)增產(chǎn)物138bp,均由寶生物工程（大連）有限公司

5、合成.兔抗人stat3多克隆抗體購自CellSignal公司;兔抗人survivin多克隆抗體購自SantaCruz公司.　　1.2方法9　　1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及MTT法檢測細(xì)胞毒作用SGC7901細(xì)胞于含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),37℃,50mL/LCO2孵箱中貼壁生長,2.5g/L胰酶消化傳代.實(shí)驗(yàn)分為空白對照組,陰性對照組（0.5mL/LDMSO），陽性對照組（AG49040μmol/L），槲皮素4個(gè)濃度組（20,40，80，160μmol/L）.取同一批次對數(shù)生長期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,5×103/孔接種于96孔板,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔.24h

6、細(xì)胞貼壁后,棄培養(yǎng)液,加200μL/孔無血清培養(yǎng)基同步化24h,再次吸棄培養(yǎng)液,加無血清培養(yǎng)基180μL/孔及各組藥物,使終體積為200μL/孔,終濃度為所需值.分別于加藥后24,48,72h測吸光度值A(chǔ)(λ=490nm).抑制率計(jì)算公式：細(xì)胞抑制率(%)=(1-A處理組/A對照組)×100%.計(jì)算IC50值,選擇3個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).　　1.2.2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)分為陰性對照組、陽性對照組、槲皮素（40μmol/L）組.細(xì)胞以5×105/mL的濃度接種于50mL培養(yǎng)瓶，每組3瓶.處理步驟同上.加藥后48h胰酶消化，收集細(xì)胞,離心（800r/min，5min）,棄

7、上清,加PBS液至總體積為1.5mL/管,上流式細(xì)胞儀（雙染法）檢測細(xì)胞凋亡.　　1.2.3RealTimeRTPCR檢測stat3和survivin基因mRNA的表達(dá)實(shí)驗(yàn)分為陰性對照組、陽性對照組、槲皮素(20,40,80μmol/L)組.細(xì)胞處理同上.收集48h細(xì)胞，用EZSpinColumn提取細(xì)胞總RNA,RealTimeRTPCR反應(yīng)參照試劑說明書進(jìn)行.9　　1.2.4WesternBlot檢測pstat3，survivin蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)分為陽性對照組、槲皮素（20,40,80μmol/L）組.細(xì)胞