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1、槲皮素抑制胃癌BGC823細(xì)胞增殖的研究論文徐永中，范鈺，姚廣濤，李儀奎【摘要】目的探討槲皮素治療胃癌細(xì)胞的作用機(jī)制。方法采用不同濃度的槲皮素處理胃癌BGC823細(xì)胞后，采用四唑鹽比色試驗(yàn)檢測(cè)癌細(xì)胞生長(zhǎng)，分別以瓊脂糖凝膠電泳和TUNEL檢測(cè)癌細(xì)胞凋亡，分別采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR和ethodsGastriccancerBGC823cellsinedbyMTTassay,andtheapoptosisinedbyagarosegelelectrophoresisandTUNELassays,respectively.Therealtime-PCRandedtostudytheexp
2、ressionofsurvivin.ResultsQuercetinhadaremarkableinhibitionongastriccancercelllineBGC823.FromDNAladderandTUNELassay,apoptosisanner.Inaddition,quercetinresultedindoRNAandproteinfromrealtime-PCRandangastriccancerBGC823cellthroughinducingapoptosisanddoa公司，用DMSO(二甲基亞砜)配成儲(chǔ)液，-20℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)用1640培養(yǎng)基稀釋?zhuān)?/p>
3、DMSO的最終濃度小于0.9%。人胃癌細(xì)胞株BGC823購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)。TriIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司。BCA蛋白分析試劑盒購(gòu)自PIERCE公司。細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自Roche公司。1.2細(xì)胞培養(yǎng)及處理胃癌BGC823細(xì)胞在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%小牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640（美國(guó)GIBCOBRL）。待細(xì)胞至指數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/ml，按每孔0.1ml接種到96孔培養(yǎng)板中，24h后，分別加入不同濃度的槲皮素，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h，每孔加入MTT1
4、00μl，作用4h后，加入DMSO100μl，孵育30min，在酶標(biāo)儀570nm處測(cè)吸光度A值，計(jì)算抑制率。1.3細(xì)胞凋亡檢測(cè)1.3.1DNA末端原位標(biāo)記染色法（TUNEL）接種胃癌細(xì)胞于24孔板，以不同濃度的槲皮素處理，48h后終止細(xì)胞培養(yǎng)，4%多聚甲醛固定30min。其余步驟按Roche公司藥盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。光鏡下計(jì)算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)（ApoptosisIndex，AI）計(jì)算方法：數(shù)5個(gè)高倍鏡＞1000個(gè)細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)量和凋亡細(xì)胞數(shù)量。AI（%）＝凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100％。1.3.2瓊脂糖凝膠電泳按照文獻(xiàn)［3］的方法進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下檢測(cè)并拍照。1.
5、4Survivin基因表達(dá)檢測(cè)1.4.1mRNA水平應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)。以Trizol抽提細(xì)胞總RNA，取總RNA1μg，以O(shè)ligodT（15mer）為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，以此cDNA鏈2μl為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，步驟參照說(shuō)明書(shū)。引物序列為：上游：5'-ATTTGAATCGCGGGACCC-3'；下游：5'-GAGAAAGGGCTGCCAGGC-3'。FAM探針：5'-CATGGGTGCCCCGACGTTGC-3'-TAMRA。以GAPDH為內(nèi)參。定量PCR步驟和PCR反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)［4］進(jìn)行。1.4.2蛋白水平采用TT法檢測(cè)槲皮素對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制
6、作用，發(fā)現(xiàn)槲皮素可明顯抑制胃癌SGC823細(xì)胞的惡性增殖，且在5～40μmol/L濃度范圍內(nèi)，呈明顯的濃度依賴(lài)性。其IC50約為45.91μmol/L。見(jiàn)圖1。2.2槲皮素誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞BGC823凋亡以不同濃度的槲皮素處理胃癌細(xì)胞后，收集細(xì)胞，分別采用瓊脂糖凝膠電泳和TUNEL檢測(cè)（見(jiàn)圖2～3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增高，DNA凝膠電泳顯現(xiàn)明顯的梯狀圖譜，且均呈濃度依賴(lài)性（P＜0.05）。2.3槲皮素對(duì)胃癌BGC823細(xì)胞survivin基因表達(dá)的影響以槲皮素處理細(xì)胞后，于不同時(shí)間收集細(xì)胞，分別采用實(shí)時(shí)定量PCR和RNA和蛋白水平明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖4
7、～5。3討論自1971年美國(guó)NCI組織首次發(fā)現(xiàn)槲皮素對(duì)Ｐ388白血病的抑制作用后，許多研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可抑制白血病、結(jié)腸癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌等多種癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡［1］。但目前尚無(wú)槲皮素處理胃癌細(xì)胞的報(bào)道。本研究采用槲皮素處理胃癌BGC823細(xì)胞，觀察了其對(duì)增殖的影響，并從端粒酶和細(xì)胞凋亡方面初步探索了其可能的機(jī)制。凋亡在調(diào)控細(xì)胞增殖、腫瘤的形成和發(fā)展中起關(guān)鍵作用［5］。本研究采用不同濃度的槲皮素處理胃癌細(xì)胞，于不同時(shí)間收集細(xì)胞，分別采用TUNEL和瓊脂糖凝膠電泳
