stat3survivin途徑介導(dǎo)槲皮素調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖和凋亡

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1、STAT3SURVIVIN途徑介導(dǎo)槲皮素調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖和凋亡【摘要】目的:觀察STAT3SURVIVIN途徑在槲皮素調(diào)控胃癌細(xì)胞SGC7901增殖和凋亡中的作用.方法:不同濃度的槲皮素及陽性對(duì)照組(AG49040μmol/L)作用細(xì)胞后,MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒作用;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡;RealtimeRTPCR,I1640,槲皮素,DMSO,AG490購(gòu)自Sigma公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司;MTT購(gòu)自Inventrogen公司;總RNA柱式提取試劑盒購(gòu)自BBI公司;RealTimePCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司.Stat3上游引物:5′CCAGTCAGT

2、GACCAGGCAGAAG3′,下游引物:5′GCACGTACTCCATCGCTGACA3′,擴(kuò)增產(chǎn)物114bp；survivin上游引物:5′AGGTCATCTCGGCTGTTCCTG3′,下游引物:5′TCATCCTCACTGCGGCTGTC3′,擴(kuò)增產(chǎn)物127bp;內(nèi)參照GAPDH上游引物:5′GTGCTTTGACAAATCCCATCTGA3′,下游引物:5′GTTACTGTCCCGGATCTTGTCCA3′,擴(kuò)增產(chǎn)物138bp,均由寶生物工程（大連）有限公司合成.兔抗人stat3多克隆抗體購(gòu)自CellSignal公司;兔抗人survivin多克隆抗體購(gòu)自S

3、antaCruz公司.　　1.2方法　　1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒作用SGC7901細(xì)胞于含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),37℃,50mL/LCO2孵箱中貼壁生長(zhǎng),2.5g/L胰酶消化傳代.實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組,陰性對(duì)照組（0.5mL/LDMSO），陽性對(duì)照組（AG49040μmol/L），槲皮素4個(gè)濃度組（20,40，80，160μmol/L）.取同一批次對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,5×103/孔接種于96孔板,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔.24h細(xì)胞貼壁后,棄培養(yǎng)液,加200μL/孔無血清培養(yǎng)基同步化24h,再次吸棄培養(yǎng)液,加無血清培養(yǎng)基180μL/孔及各組

4、藥物,使終體積為200μL/孔,終濃度為所需值.分別于加藥后24,48,72h測(cè)吸光度值A(chǔ)(λ=490nm).抑制率計(jì)算公式：細(xì)胞抑制率(%)=(1-A處理組/A對(duì)照組)×100%.計(jì)算IC50值,選擇3個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).　　1.2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、槲皮素（40μmol/L）組.細(xì)胞以5×105/mL的濃度接種于50mL培養(yǎng)瓶，每組3瓶.處理步驟同上.加藥后48h胰酶消化，收集細(xì)胞,離心（800r/min，5min）,棄上清,加PBS液至總體積為1.5mL/管,上流式細(xì)胞儀（雙染法）檢測(cè)細(xì)胞凋亡.　　1.2.3RealTimeRTPCR檢測(cè)s

5、tat3和survivin基因mRNA的表達(dá)實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、槲皮素(20,40,80μmol/L)組.細(xì)胞處理同上.收集48h細(xì)胞，用EZSpinColumn提取細(xì)胞總RNA,RealTimeRTPCR反應(yīng)參照試劑說明書進(jìn)行.　　1.2.4SF)液裂解后抽提總蛋白,Bradford法測(cè)定蛋白濃度.取變性蛋白樣品50μg上樣,SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜,半干標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)膜45min.漂洗后,加入ageproplus軟件進(jìn)行雜交信號(hào)累計(jì)吸光度(IOD)分析.　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:計(jì)量資料采用x±s,統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS11.5分析,多個(gè)樣本均數(shù)比較采用方差分析,兩兩比較用Du

6、nt檢驗(yàn),兩變量間關(guān)系分析采用直線相關(guān)分析法.　　2結(jié)果　　2.1槲皮素抑制SGC7901細(xì)胞的增殖20～160μmol/L槲皮素對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖均有抑制作用,且有隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而抑制作用增強(qiáng)、隨濃度增高抑制率增高的趨勢(shì)(圖1).　　aP<0.05vs空白對(duì)照.　　圖1槲皮素(Que)對(duì)SGC7901細(xì)胞的抑制作用（略）　　2.2槲皮素誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞的凋亡處理48h后,SGC7901細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡改變.流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示,槲皮素（40μmol/L）組細(xì)胞早期凋亡率為61.93％,陽性對(duì)照組早期凋亡率為62.80％,均明顯高于陰性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

7、(P均=0.000).　　2.3RealTimeRTPCR檢測(cè)SGC7901細(xì)胞stat3,survivinmRNA的表達(dá)胃癌SGC7901細(xì)胞株高表達(dá)stat3mRNA和survivinmRNA（圖2）.槲皮素（40μmol/L）作用細(xì)胞48h后,stat3和survivin的mRNA表達(dá)均明顯下調(diào),與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.029，P=0.020）.陽性對(duì)照組也有相似表現(xiàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005,P=0.034）