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《大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)、鑒定及氧糖剝奪模型的建立》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)、鑒定及氧糖剝奪模型的建立作者:魏愛宣李昕華閆世軍何金婷莽靖邢影邵延坤徐忠信【摘要】目的原代培養(yǎng)和鑒定大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞,并建立大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞氧糖剝奪(OGD)模型。方法大鼠星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)后,作膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細胞化學(xué)染色鑒定,應(yīng)用缺氧DHank液及缺氧培養(yǎng)罐行OGD后用臺盼藍染色及乳酸脫氫酶(LDH)漏出率檢測細胞損傷程度。結(jié)果星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)至第9天,GFAP染色陽性細胞為98.54%±2.01%;星形膠質(zhì)細胞經(jīng)不同時間OGD處理后,臺盼藍染色呈現(xiàn)不同形態(tài);OGD60min時,星形膠質(zhì)細胞LDH漏出率較對
2、照組明顯增加(P<0.05),并隨時間遞增。結(jié)論成功完成大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng),星形膠質(zhì)細胞在培養(yǎng)第9天可用于模型制備,成功建立星形膠質(zhì)細胞OGD模型?!娟P(guān)鍵詞】星形膠質(zhì)細胞;原代培養(yǎng);氧糖剝奪(OGD) 【Abstract】ObjectiveToconductprimarycultureandidentificationofratcerebralcorticalastrocytes,andtosetuptheoxygen/glucosedeprivation(OGD)model.MethodsCellspresentedintheculturewere
3、showntobeastrocytesaftercharacterizationbyimmunocytochemistry,usingspecificanti7GFAPantibody.OGDmodelwasestablishedwithhypoxicDHank′sandanaerobicchamberandidentifiedbycelldeathandLDHreleaserate.ResultsImmunohistochemistryofculturedcellshowedthatthepositiveratesofGFAPwere98.54%±2.01%at
4、the9thday;differentshapeandmotilityidentifiedbytrypanbluestainwasobservedwhenexposedtodifferentOGDtime;60minOGDcausedasignificantincreaseonthelevelsofLDHrelease(P<0.05).ConclusionsTheprimarycultureastrocytescouldbeexploredtoOGDatthe9thday.ThemodelofOGDischemiainastrocytesissuccessfu
5、llyestablishedbyhypoxicDHank′sandananaerobicchamber. 【Keywords】Astrocytes;Primaryculture;Oxygenglucosedeprivation(OGD) 研究表明在缺血缺氧性腦損傷過程中,星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元有著動態(tài)、復(fù)雜的相互作用,從而維持腦組織的正常功能和存活〔1~3〕。本實驗采用大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng),應(yīng)用體外氧糖剝奪(oxygenglucosedeprivation,OGD)建立大鼠腦皮層星形膠質(zhì)細胞缺血缺氧損傷模型,模擬體內(nèi)腦缺血過程,為今后進一步探討缺血過程中
6、星形膠質(zhì)細胞的腦保護作用機制奠定基礎(chǔ)。7 1材料與方法 1.1實驗動物出生1~2d內(nèi)的Wistar乳鼠,用于星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)。購自吉林大學(xué)動物實驗中心。 1.2大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)采用酶消化法和機械分離法相結(jié)合培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞。Wistar乳鼠分離出皮層組織,清洗后剪碎成0.5mm3的小塊,移入無菌錐底離心管內(nèi),加入胰酶,形成細胞懸液;于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育、培養(yǎng)、傳代備用?! ?.3大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞鑒定①細胞培養(yǎng)板每日置于倒置顯微鏡下觀察細胞胞體與突起形態(tài)、貼壁與生長情況。②星形膠質(zhì)細胞在培養(yǎng)第9天用膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfib
7、rillaryacidicprotein,GFAP)免疫細胞化學(xué)染色進行鑒定,顯微鏡下觀察,以在細胞膜和胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者判定為陽性,每張爬片隨機選取3個200×視野,計數(shù),取均值,計算陽性細胞百分比?! ?.4體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞OGD模型的建立①利用自行設(shè)計、長春應(yīng)用化學(xué)研究所生產(chǎn)的組裝瓶和負壓吸引裝置將DHank液通入含95%N2及5%CO2的缺氧氣體,制備缺氧DHank液,用血氣分析儀測定缺氧DHank液的氧濃度。②將真空干燥器通入缺氧氣體制成缺氧罐,用麻醉氣體分析儀測定缺氧罐內(nèi)氧含量。③將培養(yǎng)第9天的星形膠質(zhì)細胞用缺氧DHank