大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)、鑒定及氧糖剝奪模型的建立

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1、大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)、鑒定及氧糖剝奪模型的建立作者：魏愛宣李昕華閆世軍何金婷莽靖邢影邵延坤徐忠信【摘要】目的原代培養(yǎng)和鑒定大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞，并建立大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞氧糖剝奪(OGD)模型。方法大鼠星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)后，作膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細胞化學(xué)染色鑒定，應(yīng)用缺氧DHank液及缺氧培養(yǎng)罐行OGD后用臺盼藍染色及乳酸脫氫酶(LDH)漏出率檢測細胞損傷程度。結(jié)果星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)至第9天，GFAP染色陽性細胞為98.54%±2.01%;星形膠質(zhì)細胞經(jīng)不同時間OGD處理后，臺盼藍染色呈現(xiàn)不同形態(tài);OGD60min時，星形膠質(zhì)細胞LDH漏出率較對

2、照組明顯增加(P<0.05)，并隨時間遞增。結(jié)論成功完成大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)，星形膠質(zhì)細胞在培養(yǎng)第9天可用于模型制備，成功建立星形膠質(zhì)細胞OGD模型?！娟P(guān)鍵詞】星形膠質(zhì)細胞;原代培養(yǎng);氧糖剝奪(OGD)　　【Abstract】ObjectiveToconductprimarycultureandidentificationofratcerebralcorticalastrocytes,andtosetuptheoxygen/glucosedeprivation(OGD)model.MethodsCellspresentedintheculturewere

3、showntobeastrocytesaftercharacterizationbyimmunocytochemistry,usingspecificanti7GFAPantibody.OGDmodelwasestablishedwithhypoxicDHank′sandanaerobicchamberandidentifiedbycelldeathandLDHreleaserate.ResultsImmunohistochemistryofculturedcellshowedthatthepositiveratesofGFAPwere98.54%±2.01%at

4、the9thday;differentshapeandmotilityidentifiedbytrypanbluestainwasobservedwhenexposedtodifferentOGDtime;60minOGDcausedasignificantincreaseonthelevelsofLDHrelease(P<0.05).ConclusionsTheprimarycultureastrocytescouldbeexploredtoOGDatthe9thday.ThemodelofOGDischemiainastrocytesissuccessfu

5、llyestablishedbyhypoxicDHank′sandananaerobicchamber.　　【Keywords】Astrocytes;Primaryculture;Oxygenglucosedeprivation(OGD)　　研究表明在缺血缺氧性腦損傷過程中，星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元有著動態(tài)、復(fù)雜的相互作用，從而維持腦組織的正常功能和存活〔1～3〕。本實驗采用大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)，應(yīng)用體外氧糖剝奪(oxygenglucosedeprivation,OGD)建立大鼠腦皮層星形膠質(zhì)細胞缺血缺氧損傷模型，模擬體內(nèi)腦缺血過程，為今后進一步探討缺血過程中

6、星形膠質(zhì)細胞的腦保護作用機制奠定基礎(chǔ)。7　　1材料與方法　　1.1實驗動物出生1～2d內(nèi)的Wistar乳鼠，用于星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)。購自吉林大學(xué)動物實驗中心。　　1.2大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)采用酶消化法和機械分離法相結(jié)合培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞。Wistar乳鼠分離出皮層組織，清洗后剪碎成0.5mm3的小塊，移入無菌錐底離心管內(nèi)，加入胰酶，形成細胞懸液;于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育、培養(yǎng)、傳代備用?！　?.3大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞鑒定①細胞培養(yǎng)板每日置于倒置顯微鏡下觀察細胞胞體與突起形態(tài)、貼壁與生長情況。②星形膠質(zhì)細胞在培養(yǎng)第9天用膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfib

7、rillaryacidicprotein,GFAP)免疫細胞化學(xué)染色進行鑒定，顯微鏡下觀察，以在細胞膜和胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者判定為陽性，每張爬片隨機選取3個200×視野，計數(shù)，取均值，計算陽性細胞百分比?！　?.4體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞OGD模型的建立①利用自行設(shè)計、長春應(yīng)用化學(xué)研究所生產(chǎn)的組裝瓶和負壓吸引裝置將DHank液通入含95%N2及5%CO2的缺氧氣體，制備缺氧DHank液，用血氣分析儀測定缺氧DHank液的氧濃度。②將真空干燥器通入缺氧氣體制成缺氧罐，用麻醉氣體分析儀測定缺氧罐內(nèi)氧含量。③將培養(yǎng)第9天的星形膠質(zhì)細胞用缺氧DHank