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1、西尼羅熱病毒RT—PCR檢測(cè)方法的建立一25一文章編號(hào):1005—944x(2005)05一OO25—03西尼羅熱病毒RT—PCR檢測(cè)方法的建立姜焱★張常印陳國(guó)強(qiáng)(江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局210001)摘要:參考Genebank發(fā)表的西尼羅熱病毒(WestNilevirus,WNV)E糖蛋白基因序列,自行設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物,對(duì)WNv進(jìn)行RT—PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分析,呈現(xiàn)一條約400bp的條帶,將其克隆入pMD18一T—Vector載體中,并進(jìn)行序列測(cè)定,與已發(fā)表的WNV基因比較發(fā)現(xiàn),核苷酸的同源性為99.7%,證實(shí)為Ⅵ的E基因,通過(guò)對(duì)樣品多次檢測(cè),都能擴(kuò)增出一
2、條約4O0bp的條帶,表明該方法比較穩(wěn)定.關(guān)鍵詞:西尼羅熱;E基因;RT—PCR;克隆;序列測(cè)定西尼羅熱(WestNileFever,WNF)是由西尼羅病毒(westnilevirus,Ⅵ)感染引起的一種急性傳染病"】.Ⅵ是一種蟲(chóng)媒病毒,黃病毒科,為40—60nln的20面體立體對(duì)稱(chēng)型單股正鏈RNA病毒,有囊膜,與日本乙型腦炎病毒,圣路易腦炎病毒,墨累河谷腦炎病毒和Kun-jiIl病毒等黃病毒在抗原方面有著密切的關(guān)系.WNv于1937年在烏干達(dá)的西尼羅地區(qū)從一位發(fā)熱婦女的血液中首次分離到"】,20世紀(jì)5o年代在埃及從病人,鳥(niǎo)和蚊子也分離到病毒b】.Ⅵw~,沿"鳥(niǎo)一
3、蚊一鳥(niǎo)"途徑在自然界中循環(huán),鳥(niǎo)類(lèi)是Ⅵw~,的擴(kuò)散宿主,蚊子(尤其是庫(kù)蚊)是主要的傳播媒介,攜帶西尼羅病毒的蚊子叮咬人是本病的自然傳染途徑[210由引起的是黃病毒中流行最廣的一種疾病,其分布在非洲和歐亞大陸的許多國(guó)家.一般癥狀較輕,很少侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng),病死率低.在20世紀(jì)90年代中期之前除1951—1954年和1957年在以色列及1974年在南非外,WNF很少暴發(fā)流行.20世紀(jì)9o年代中期以后,WNF的暴發(fā)范圍和強(qiáng)度明顯增加,病情嚴(yán)重,病死率高.自1994年至今,WNF在北非,中東,歐洲和北美等地區(qū)高速流行,1999年首次在西半球的美洲國(guó)家,主要是在美國(guó)發(fā)生流行,
4、并引起馬和鳥(niǎo)類(lèi)等動(dòng)物發(fā)病死亡[5-121.西尼羅熱確診有賴(lài)于實(shí)驗(yàn)室診斷.血清學(xué)檢驗(yàn)是最常用的實(shí)驗(yàn)室臨床檢驗(yàn)方法.由于乙腦等病毒與西尼羅病毒間存在免疫交叉反應(yīng),因此,進(jìn)行血清學(xué)診斷時(shí),必須結(jié)合病人居住地疫情和有無(wú)疫區(qū)旅行史,病人的免疫狀況和預(yù)防黃病毒(如乙腦,黃熱病等)接種史,病人的發(fā)病及標(biāo)本采集時(shí)間和臨床疑似診斷等情況,依據(jù)特異的鑒別試驗(yàn)(如病毒中和試驗(yàn))作出確診[1310西尼羅病毒的分離對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求很高,非一般臨床實(shí)驗(yàn)室所能進(jìn)行.以RT—PCR進(jìn)行西尼羅病毒RNA檢驗(yàn)是目前最快速,特異,敏感的方法.本研究通過(guò)分析Ⅵ的E基因,設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)引物,通過(guò)對(duì)RT—P
5、CR條件的優(yōu)化及對(duì)樣品的多次檢測(cè),構(gòu)建了特異,敏感,快速的檢測(cè)WNv的RT—PCR方法.l材料和方法1.1材料1.1.1病毒州購(gòu)自美國(guó)FortDodgeAn-污物可根據(jù)條件和需要,或堆積泥封發(fā)酵后肥田,或加工成飼料,或用作食用菌的培養(yǎng)基,或制沼氣等.3.3病死畜禽無(wú)害化處理農(nóng)村散養(yǎng)死亡的畜禽,由于條件所限和太分散零星,一般很難處理后再利用.建議利用廢棄的水井,地窖或根據(jù)居民居住密集情況,酌情定點(diǎn)深挖土井,上面蓋上水泥蓋等,每有病死畜禽即投入其中后,撒上石灰,蓋上井蓋,再定期澆上汽油,柴油等焚燒,待填至離地平面1米時(shí),再填土深埋.嚴(yán)禁隨意丟棄和食用病死畜禽,特別是嚴(yán)
6、禁在溝渠河流內(nèi)丟棄病死畜禽.3.4加強(qiáng)集市屠宰場(chǎng)管理集市屠宰畜禽,一般多是禽類(lèi)的宰殺脫毛.可將這些經(jīng)營(yíng)戶固定集中于一處,不可到處經(jīng)營(yíng).獸醫(yī)衛(wèi)生管理人員和市場(chǎng)管理人員,可每天將羽毛,角皮,腸等污物集中消毒處理,對(duì)宰殺場(chǎng)地沖洗干凈后,噴灑消毒.對(duì)加工畜禽熟制品的地點(diǎn),要對(duì)加工廢棄物進(jìn)行無(wú)害化處理,設(shè)立廢水處理池,對(duì)廢水處理池進(jìn)行無(wú)害化處理.農(nóng)村的獸醫(yī)衛(wèi)生管理,絕不單單是畜牧獸醫(yī)部門(mén)的工作,這需要全社會(huì)的共同努力.只有在南水北調(diào)工程未實(shí)施之前,提前做好獸醫(yī)衛(wèi)生管理工作,搞好沿湖地區(qū)的公共衛(wèi)生,才能確保南水北調(diào)工程的調(diào)水質(zhì)量,有效控制畜禽或人畜共患傳染病的發(fā)生和流行,保證
7、當(dāng)?shù)睾途┙虻貐^(qū)人們的身體健康,促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展.這不僅是微山湖地區(qū)所應(yīng)做好的事情,也是整個(gè)南水北調(diào)工程沿線地區(qū)都應(yīng)切實(shí)關(guān)注的工作.CHINESEJOURNALOFANIMALQUARANTINE2005,22(5)一26—1.1.4引物設(shè)計(jì)參照Genebank公開(kāi)發(fā)表的E基因序列,自行設(shè)計(jì)了如下引物,擴(kuò)增長(zhǎng)度為400bp,引物由上海皓嘉公司合成.5'一弓I物5'一ACTGAATIEACGT-GACCCGGCI'CCCCG一3'3'一弓I物5'一CGGGATCCGCCG-GTAG【1[G幾℃C一3'1.2方法1.2.1的RNA提取參照TRIZOL說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA的
8、提取.取5
