牛腸道病毒rt—pcr檢測方法建立和初步應(yīng)用

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1、牛腸道病毒RT—PCR檢測方法建立和初步應(yīng)用　　摘要：參照GenBank中登錄的牛腸道病毒（BEV）全基因組序列，針對其3D基因設(shè)計合成了1對特異性引物，提取病毒RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行PCR擴增，經(jīng)條件優(yōu)化，建立了BEV的RT-PCR檢測方法，并對該方法的特異性、敏感性進行驗證。結(jié)果顯示，該方法從分離的牛腸道病毒中擴增出了732bp的特異性目的片段；且對牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛輪狀病毒（BRV）、牛冠狀病毒（BCoV）等相關(guān)病毒均無交叉反應(yīng)；其檢出敏感度達10-1TCID50。應(yīng)用該方法對山東地區(qū)84份臨床疑似發(fā)病牛樣品進行檢測，21份為

2、陽性，陽性檢出率為25%。關(guān)鍵詞：牛腸道病毒；3D基因；RT-PCR；檢測中圖分類號：S852.65+3文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）02-0013-04牛腸道病毒（Bovineenterovirus，BEV）屬于小RNA病毒科、腸道病毒屬，呈球形，大小為25～308nm，是無囊膜單股正鏈RNA病毒[1]。自1959年Moll和Davis[2]首次分離到BEV以來，很多國家和地區(qū)先后報道了牛腸道病毒的感染情況[3～5]。腸道病毒是脊椎動物腸道中原有的棲居者，可以從患腸道疾病、肺炎、呼吸系統(tǒng)疾病和生殖障礙疾病的牛分泌物或排泄物中分離獲得，也可以從正常牛的糞便樣品中分

3、離，還存在于牛糞便污染的環(huán)境或水體中，常作為糞便污染指示劑[6]。據(jù)研究報道，牛腸道病毒在國外牛群中的陽性率約為17.6%～80%[7]，而在我國，有關(guān)此病的病原學及流行病學調(diào)查的報道很少。近年來，山東省周邊某些牛場發(fā)生了以水樣和血便等嚴重腹瀉為特征的疾病，致使奶牛的食欲和產(chǎn)奶量大幅下降。本研究結(jié)合本實驗室分離獲得的牛腸道病毒基因和GenBank登錄的牛腸道病毒全基因組序列，針對其3D基因的相對保守區(qū)域，設(shè)計1對特異性引物，建立了牛腸道病毒的RT-PCR檢測方法，并初步應(yīng)用于臨床送檢樣本的檢測，具有較好的敏感性和特異性，為國內(nèi)牛腸道病毒的臨床檢測及流行病學監(jiān)測提供了有力支持。1材料與方法

4、1.1試驗材料1.1.1毒株和樣品來源病料樣品為山東省某牛場發(fā)生腹瀉癥狀的病牛糞便。BVDVOregonC24V8病毒株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；牛腸道病毒（BEV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）、牛輪狀病毒（BRV）、牛冠狀病毒（BcoV）、MDBK正常細胞等均由山東省農(nóng)業(yè)科學院奶牛研究中心保存。臨床組織樣品來自牛場送檢的疑似發(fā)病樣品，共84份，主要包括血液、糞便、淋巴結(jié)、腸等。1.1.2主要試劑生理鹽水、青霉素、鏈霉素購自Hyclone公司；EasyPureViralDNA/RNAKit、TransScriptⅡFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix購自

5、北京全式金生物技術(shù)有限公司；rTaqDNA聚合酶、dNTP、RNA酶抑制劑、DNAMarkerDL2000購自寶生物工程（大連）有限公司。1.2試驗方法1.2.1引物的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank已登錄的BEVK2577株（AF123432）、SL305株（AF123433）、VG-5-27株（NC_001859）等毒株的全序列，分析BEV3D基因的保守區(qū)，設(shè)計引物BEVF：5′GAGCCCAGTGTTTTCTTTGATGTTTTC3′和BEVR：5′AAAGTTGATCAATAAAGTGCTTGCA3′，擴增片段大小為732bp。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，稀釋成20μmo

6、l/L，-20℃保存。1.2.2病料處理將病料按1∶5加入滅菌生理鹽水研磨，經(jīng)反復凍融后，按每毫升加入青霉素、鏈霉素各1000單位，以3000r/min離心20min，取上清液用于試驗或-70℃保存?zhèn)溆谩?.2.3病毒RNA的提取取200μl病料處理液，按EasyPureViralDNA/RNAKit說明書進行操作。1.2.4反轉(zhuǎn)錄合成cDNA將提取的RNA按照TransScriptⅡFirst-StrandcDNASynthesis8SuperMix說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。1.2.5RT-PCR檢測方法的建立以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板進行PCR擴增，對PCR反應(yīng)體系（模板、酶、

7、引物、鎂離子、dNTPs的濃度）、反應(yīng)條件（變性、退火、延伸的溫度及循環(huán)次數(shù)）進行調(diào)整優(yōu)化，確定最佳PCR反應(yīng)條件。1.2.6RT-PCR特異性試驗應(yīng)用建立的RT-PCR方法分別對BEV、BVDV、IBRV、BCoV、BRV、MDBK正常細胞進行檢測，驗證該檢測方法的特異性。1.2.7病毒的培養(yǎng)選擇細胞形態(tài)良好的MDBK單層細胞，棄去營養(yǎng)液后用PBS清洗細胞。按照1%的細胞培養(yǎng)量接種病料處理液，于37℃感作1h，棄去感作液，加入維持