survivin shrna真核表達載體的構建及其生物學作用_論文

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1、SurvivinshRNA真核表達載體的構建及其生物學作用作者：謝富華，吳小云，王潤秀，熊亮，梁念慈【摘要】目的：構建存活素（survivin）基因短發(fā)夾RNA(shRNA)的表達質粒，為乳腺癌RNAi介導的基因治療打下基礎.方法：設計并合成有小發(fā)夾結構的8條survivinshRNA對應模板序列，退火并與pShuttleCMV載體重組質粒；將重組質粒轉染人乳腺癌細胞MCF7；MTT實驗篩選出最有效質粒及其有效濃度，流式細胞術檢測細胞周期的變化，經Hoechst染色觀察凋亡情況，RTPCR和WesternBlot檢測survivin基因的表達情況.結果：成功構建重組質

2、粒并篩選出最有效質粒及其有效濃度；細胞受阻于G2/M期，并通過熒光染色發(fā)現(xiàn)有凋亡細胞；survivin基因表達受到抑制.結論：構建的重組質粒能抑制survivin基因的表達，這為研究乳腺癌RNAi介導的基因治療打下基礎.【關鍵詞】survivin；RNA干擾；shRNA　　0引言存活素（survivin）基因幾乎表達于所有常見的人類腫瘤組織，尤見于乳腺癌和肺癌［1］.有研究證明將小于30個核苷酸的小干擾RNA（smallinterferencingRNA,10/10siRNA）或短發(fā)夾RNA(shRNA)表達載體轉入哺乳動物細胞中，同樣能產生沉默效應.目前，其載體構建大多是

3、用RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動子U6或H1進行表達的［2-3］，但是用RNApolⅡ依賴的巨細胞病毒立即早期啟動子同樣有效［4］.本實驗我們設計針對survivin基因的shRNA表達質粒，將其轉染人乳腺癌MCF7細胞，初步探討其誘導MCF7細胞凋亡情況及對survivin基因表達的影響.　　1材料和方法材料pShuttleCMV載體（產地ambion公司）；Lipofectamine2000轉染試劑盒(invitrogen)；各種限制性內切酶和T4DNA連接酶（大連寶生物公司）；總RNA提取試劑盒(加拿大BioBasic公司)；逆轉錄聚合酶鏈反應(RTPCR)試劑盒（

4、美國Qiagen公司）.方法的設計根據(jù)survivin基因的序列在線設計3個可干擾序列：①5′GGACCACCGCATCTCTACATTCAAGAAC3′,②5′ACAGAGAAAGAGCCAAGAACAAA3′,③5′AATTTGAGGAAACTGCGGAGA3′和一個錯義序列5′TATGAGAATGGCAGCGAGATA3′（其堿基組成同序列③，但排列順序不同），同源分析未見相同序列.重組質粒的構建和鑒定shRNA轉錄模板DNA鏈的設計：按pShuttle10/10CMV載體要求以反向重復方式設計發(fā)夾結構：正義鏈：5′CTAGT反向序列TCTCTTG

5、AA正向序列C3′，反義鏈：5′TCGAG正向序列TTCAAGAGA反向序列A3′.重組質粒的構建：模板鏈合成并退火，將其定向克隆至穿梭載體pShuttleCMV中；轉化DH5α感受態(tài)細胞，氨芐青霉素篩選單克隆，分別命名為pShuttlesurvivin(13)和pShuttlecontrol.重組質粒的鑒定：提取質粒分別用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切，取初步鑒定的質粒送上海生物工程技術服務有限公司測序.細胞培養(yǎng)與轉染乳腺癌細胞株MCF7用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃含50mL/LCO2的培養(yǎng)箱中.轉染前24h將約1×105個細胞

6、接種至6孔板，轉染時細胞融合度達30%～50%.按Lipofectamine2000操作手冊進行轉染：用質粒pShuttlesurvivin(13)以50nmol/L的濃度分別轉染細胞，設立陰性（加pShuttlecontrol）和空白對照組（加Lipofectamine2000），每組設3個平行孔，培養(yǎng)24h后行MTT檢測，篩選出最有效的shRNA表達質粒，將最有效的質粒分別以5，10，50，100，150nmol/L的終濃度轉染MCF7細胞，每組設3個平行孔，設立對照組，培養(yǎng)24h后再次行MTT檢測［5］.流式細胞術檢測接種MCF7細胞于60mm平皿中（2×1

7、06/皿）.接種后24h，以最有效質粒的最佳濃度轉染細胞，設陰性和空白對照組.轉染后48h收集細胞，1000r/min離心510/10min，棄上清，PBS清洗1次，離心去PBS，加入預冷的700mL/L的乙醇，4℃固定16h以上.離心去乙醇，PBS清洗1次，加mL50mg/LPI（含100mg/LRNaseA）于避光處染色30min，用CoulterEPTCSXL31240流式細胞儀進行檢測.熒光染色檢測凋亡取普通潔凈蓋玻片于750mL/L乙醇中浸泡24h以上，風干，將蓋玻片置于六孔板內，種入MCF7細胞培養(yǎng)