真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其生物學(xué)作用

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1、真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其生物學(xué)作用ok3allinterferencingRNA,siRNA)或短發(fā)夾RNA(shRNA)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,同樣能產(chǎn)生沉默效應(yīng).目前,其載體構(gòu)建大多是用RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動(dòng)子U6或H1進(jìn)行表達(dá)的[2-3],但是用RNApolⅡ依賴的巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子同樣有效[4].本實(shí)驗(yàn)我們?cè)O(shè)計(jì)針對(duì)survivin基因的shRNA表達(dá)質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF7細(xì)胞,初步探討其誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞凋亡情況及對(duì)survivin基因表達(dá)的影響.1材料和方法1.1材料pShuttle1.0CMV載體(產(chǎn)地ambion公司);Lipofectamine200

2、0轉(zhuǎn)染試劑盒(invitrogen);各種限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶(大連寶生物公司);總RNA提取試劑盒(加拿大BioBasic公司);逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)試劑盒(美國(guó)Qiagen公司).1.2方法1.2.1shRNA的設(shè)計(jì)根據(jù)survivin基因的序列在線設(shè)計(jì)3個(gè)可干擾序列:①5′GGACCACCGCATCTCTACATTCAAGAAC3′,②5′ACAGAGAAAGAGCCAAGAACAAA3′,③5′AATTTGAGGAAACTGCGGAGA3′和一個(gè)錯(cuò)義序列5′TATGAGAATGGCAGCGAGATA3′(其堿基組成同序列③,但排列順序不同)

3、,同源分析未見(jiàn)相同序列.1.2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定shRNA轉(zhuǎn)錄模板DNA鏈的設(shè)計(jì):按pShuttle1.0CMV載體要求以反向重復(fù)方式設(shè)計(jì)發(fā)夾結(jié)構(gòu):正義鏈:5′CTAGT反向序列TCTCTTGAA正向序列C3′,反義鏈:5′TCGAG正向序列TTCAAGAGA反向序列A3′.重組質(zhì)粒的構(gòu)建:模板鏈合成并退火,將其定向克隆至穿梭載體pShuttle1.0CMV中;轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,氨芐青霉素篩選單克隆,分別命名為pShuttlesurvivin(13)和pShuttlecontrol.重組質(zhì)粒的鑒定:提取質(zhì)粒分別用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切,取初步鑒定的質(zhì)粒送上

4、海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序.1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株MCF7用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃含50mL/LCO2的培養(yǎng)箱中.轉(zhuǎn)染前24h將約1×105個(gè)細(xì)胞接種至6孔板,轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)30%~50%.按Lipofectamine2000操作手冊(cè)進(jìn)行轉(zhuǎn)染:用質(zhì)粒pShuttlesurvivin(13)以50nmol/L的濃度分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞,設(shè)立陰性(加pShuttlecontrol)和空白對(duì)照組(加Lipofectamine2000),每組設(shè)3個(gè)平行孔,培養(yǎng)24h后行MTT檢測(cè),篩選出最有效的shRNA表達(dá)質(zhì)粒,將最有效的質(zhì)粒分別以5

5、,10,50,100,150nmol/L的終濃度轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞,每組設(shè)3個(gè)平行孔,設(shè)立對(duì)照組,培養(yǎng)24h后再次行MTT檢測(cè)[5].1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)接種MCF7細(xì)胞于60mm平皿中(2×106/皿).接種后24h,以最有效質(zhì)粒的最佳濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞,設(shè)陰性和空白對(duì)照組.轉(zhuǎn)染后48h收集細(xì)胞,1000r/min離心5min,棄上清,PBS清洗1次,離心去PBS,加入預(yù)冷的700mL/L的乙醇,4℃固定16h以上.離心去乙醇,PBS清洗1次,加0.5mL50mg/LPI(含100mg/LRNaseA)于避光處染色30min,用CoulterEPTCSXL31240流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)

6、.1.2.5Hoechst熒光染色檢測(cè)凋亡取普通潔凈蓋玻片于750mL/L乙醇中浸泡24h以上,風(fēng)干,將蓋玻片置于六孔板內(nèi),種入MCF7細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜.加入含最有效質(zhì)粒的最佳濃度的培養(yǎng)基,作用24h,設(shè)陰性和空白對(duì)照組.吸盡培養(yǎng)液,加入0.5mL固定液,4℃固定過(guò)夜.去固定液,用PBS洗兩遍,每次3min,吸盡液體.加入0.5mLHoechst33258染色液,搖床上染色5min.用PBS洗兩遍,每次3min.加一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上,蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片,使細(xì)胞接觸封片液,熒光顯微鏡檢測(cè).1.2.6RTPCR檢測(cè)按一步法RTPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA后行PCR.survi

7、vin基因引物(產(chǎn)物為166bp)P1:5′cagatttgaatcgcgggaccc3′,P2:5′ccaagtctggctcgttctcag3′;GAPDH引物(產(chǎn)物為280bp)P1:5′gtagaggcagggatgatgttc3′,P2:5′gagttagctcactcattaggc3′.反應(yīng)條件:50℃反轉(zhuǎn)錄30min;95℃初始PCR激活反應(yīng)15min;94℃變性0.5min,55℃退火1min,72℃