小鼠著床前胚胎miR125a，miR295和miR181b的表達(dá).doc

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1、小鼠著床前胚胎miR125a，miR295和miR181b的表達(dá)作者：張平，楊艷紅*，王曉紅，王珺，姜峰，羅亞寧，姚元慶【摘要】目的：研究小鼠著床前胚胎發(fā)育過程中miRNA表達(dá)水平的變化，探討miRNA對著床前胚胎發(fā)育過程的作用.方法：建立小鼠超排、交配系統(tǒng)，收集著床前胚胎，提取smallRNA；采用miRNA特異RT引物進行反轉(zhuǎn)錄，采用SYBRGreen實時定量PCR技術(shù)，研究miR125a,miR295和miR181b在小鼠著床前胚胎發(fā)育過程中表達(dá)水平的變化.結(jié)果：著床前胚胎發(fā)育的各階段均表達(dá)miR125a,miR295和miR181b；隨

2、著胚胎發(fā)育進程，miR295的表達(dá)呈逐漸上升的趨勢；miR125a在卵母細(xì)胞到2細(xì)胞發(fā)育階段呈下降趨勢，以后隨發(fā)育進程呈逐漸上升趨勢.結(jié)論：小鼠著床前胚胎中表達(dá)miRNA，著床前胚胎的發(fā)育和分化過程可能受到miRNA的調(diào)控.【關(guān)鍵詞】微RNAs；小鼠；胚胎發(fā)育0引言　　微小RNA（miRNAs）是一類由大約22個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA；在個體發(fā)育不同時期有不同的表達(dá)模式［1］，miRNAs的特定功能與其表達(dá)水平高低及其對下游靶基因的調(diào)控作用有關(guān)，研究特定組織和發(fā)育的特定階段miRNA的時空表達(dá)模式，是理解其作用的關(guān)鍵步驟，也是目前分子生物學(xué)研究的前沿和

3、熱點問題.本研究采用miRNA特異的RT引物進行反轉(zhuǎn)錄，SYBRGreen實時定量PCR技術(shù)，研究miR125a，miR295和miR181b在小鼠著床前胚胎發(fā)育過程中表達(dá)水平的變化，探討了miRNA在哺乳動物著床前胚胎發(fā)育過程中的作用.1材料和方法1.1材料昆白系健康小白鼠，雌雄兼用，購自中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于本院婦產(chǎn)科動物房，光照、黑暗各12h；嚴(yán)格控制溫、濕度，自由攝食.昆白系6wk雌鼠（22~25g）購回后飼養(yǎng)1wk，開始實驗.昆白系8~9周齡成年雄鼠購回后單籠單放飼養(yǎng)3～4d后用于交配，每2mo更換一批.mirVanaTM

4、miRNAIsolationKit,購自Ambion公司.miR125a，miR295和miR181b特異反轉(zhuǎn)錄引物和PCR引物以及內(nèi)參照5SrRNA的引物均購自Ambion公司的mirVanaTMqRTPCRPrimerSet.定量PCR試劑盒（SYBRGreen染料）及LightCycler3定量PCR儀為Roche公司產(chǎn)品.1.2方法51.2.1小鼠著床前胚胎的收集挑選發(fā)情前期的雌性小鼠于16:30腹腔注射PMSG（7.5U/只），注射PMSG48h腹腔注射HCG(7.5U/只)，當(dāng)晚雌、雄鼠1∶1合籠交配，次日清晨看陰栓.于交配后0.5,1.5,

5、2.5,4.5d，分別收集卵母細(xì)胞和各發(fā)育階段著床前胚胎［2］放入裂解液，-80℃保存待用.1.2.2低分子量RNA的提取采用mirVanaTMmiRNAIsolationKit提取總RNA，采用PEG6000（購自加拿大BBI公司）分離低分子量RNA.實驗步驟簡述如下：解凍-80℃冰箱保存的胚胎裂解液，震蕩混勻合并同一發(fā)育時期的樣品計算裂解液的體積；加入1/10體積的homogenateadditive，上下顛倒混勻，冰上放置10min；加入與裂解液等體積的AcidPhenolChloroform，劇烈震蕩30～60s，室溫靜置2~3min，12000g低

6、溫離心10min.上清移入新的離心管中，加入等體積異丙醇、0.5μL糖原上下顛倒混勻，室溫靜置30min，12000g離心10min；棄上清用750mL/L乙醇清洗沉淀后室溫干燥2~3min，加入DEPC處理過的去離子水10~15μL，65℃恒溫5min.取2μL樣品分光光度計定量，剩余樣品補水至總體積為50μL后再加入等體積的PEG6000分離低分子量RNA［3］（含miRNA），取20ng低分子量RNA進行實驗.1.2.3反轉(zhuǎn)錄體系及反應(yīng)參數(shù)取20ng低分子量RNA，100UMMLV（購自Invitrogen公司）,1μmol/μLmiRNA特異反轉(zhuǎn)錄引物

7、，總體系為10μL反轉(zhuǎn)錄合成cDNA.先將模板、引物與H2O混勻后65℃變性5min后置冰上，再加入酶、PCRBuffer等試劑，反轉(zhuǎn)錄參數(shù)為16℃30min，37℃30min，70℃10min，4℃保存.1.2.5熒光定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)取2μLRT產(chǎn)物為模板及miRNA特異性PCR引物1μL，采用定量PCR試劑盒（SYBRGreen染料）及LightCycler3定量PCR儀進行PCR擴增，反應(yīng)體系為20μL，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作.PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃10min，1個循環(huán)；95℃15s，60℃30s，74℃讀板，共進行40個循環(huán).1.2.6PC

8、R產(chǎn)物的120mg/L聚