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1、吡格列酮和羅格列酮對脂多糖誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細胞增殖的影響【摘要】目的：觀察胰島素增敏劑——噻唑烷二酮類(TZD)藥物吡格列酮和羅格列酮對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞(VSMCs)異常增殖的影響。方法：組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞；LPS（0.1，1，10mg·L-1）干預(yù)血管平滑肌細胞不同時間（0，12，24，48，72h）后，分別用吡格列酮和羅格列酮與10mg·L-1LPS共同孵育72h，四甲基偶氮咗鹽微量酶比色（MTT）法檢測血管平滑肌細胞增殖。結(jié)果：10mg·L-1
2、LPS孵育72h導(dǎo)致血管平滑肌細胞增殖程度最明顯（P<0.01）;吡格列酮和羅格列酮可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞增殖。結(jié)論：噻唑烷二酮類代表藥吡格列酮和羅格列酮均對LPS誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞異常增殖具有抑制作用，該類藥物可能在治療心血管疾病方面有較好的應(yīng)用前景。【關(guān)鍵詞】脂多糖；血管平滑肌細胞；增殖；吡格列酮；羅格列酮目前認為動脈粥樣硬化（artherosclerosis;AS）是一種免疫調(diào)節(jié)的炎癥性疾病,細菌性感染是臨床上常見的致病原因,其中以內(nèi)毒素血癥最為多見,其主要毒性成分是
3、脂多糖（LPS）［1］。血流中的LPS可損傷內(nèi)皮細胞、血小板,甚至經(jīng)破損的血管壁直接作用于血管平滑肌細胞(vascularsmoothmusclecells,VSMCs),導(dǎo)致其增殖和遷移，引起一系列心血管反應(yīng)。而VSMCs的增殖與遷移是動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，可加速動脈粥樣硬化的進程。胰島素增敏劑--噻唑烷二酮類(TZD)藥物,是目前臨床上治療2型糖尿病的一類新的藥物,其代表藥為羅格列酮(rosiglitazone，Rosi)和吡格列酮(pioglitazone,PIO)。近年研究發(fā)
4、現(xiàn)此類藥在心血管保護、炎癥形成的抑制中起關(guān)鍵作用［2］。本研究通過觀察吡格列酮和羅格列酮對LPS誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞(VSMCs)異常增殖的影響,探討Pio和Rosi在治療動脈粥樣硬化中的可能作用。1材料與方法1.1材料1.1.1動物SD大鼠由濰坊醫(yī)學(xué)院試驗動物中心提供,體重100～150g。1.1.2試劑DMEM培養(yǎng)基（美國Gibico公司）;LPS（Sigma）;MTT(sangon);Pio(江蘇恒瑞制藥公司)；Rosi（革蘭素史克）；胰蛋白酶（美國Gibico公司）；胎牛血清(杭州四季青
5、生物工程公司)；兔抗鼠α-actin抗體及sABC試劑盒均購自武漢博士德公司。1.2方法1.2.1大鼠胸主動脈VSMCs的培養(yǎng)與鑒定4用組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠TASMCs。大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉以45mg/kg麻醉后,無菌條件下迅速取出胸主動脈,仔細剝?nèi)ネ饽?沿縱向剪開血管，刮去內(nèi)皮細胞,以無血清培養(yǎng)液洗2～3次,剪碎成1mm×1mm×1mm,均勻種植于瓶底壁,加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液［3］,在5％CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)，靜止4d。觀察后換液。細胞鋪滿瓶底80%以上時加入2.5g/L胰蛋白
6、酶消化,1∶2分裝傳代，使用含10％胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。本實驗培養(yǎng)的細胞相差顯微鏡觀察:細胞外觀呈長梭形，細胞生長致密時排列成束，并可重疊生長，表現(xiàn)為典型的“波峰”與“浪谷”狀。采用免疫組化法對VSMC(α-actin)進行鑒定:激光共聚焦顯微鏡觀察，證實為VSMCs。實驗所用細胞為3～8代。1.2.2實驗分組在進行干預(yù)前，無血清培養(yǎng)24h使細胞同步化，然后分組：①空白對照組：加入含有1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；②LPS0.1，1，10mg·L-1組作用不同時間（12，24，48，72h）；
7、③10mg·L-1LPS與Pio（1，10，100umol·L-1）共同作用72h；④10mg·L-1LPS與Rosi(1，10，100umol·L-1）共同作用72h。1.2.3MTT法測定細胞增殖用0.25%胰蛋白酶消化細胞并用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)制成5×104個/ml，將細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中,每孔接種100μl,在37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)至細胞生長成次融合狀態(tài)時,無血清培養(yǎng)24h后,加入各種干預(yù)因素繼續(xù)培養(yǎng),同時設(shè)調(diào)零組和正常對照組(未加任何刺激因素),每組設(shè)
8、3個復(fù)孔,干預(yù)結(jié)束后每孔加入MTT(5g/l)20μl培養(yǎng)4h,棄去孔內(nèi)液體,每孔加入DMSO150μl,震蕩10min后,在自動酶標檢測儀上讀取波長為570nm的光吸收值(A)。實驗結(jié)果以A值表示,A值與活細胞的增殖呈正比,A值越大,表明細胞增殖越旺盛。每項試驗重復(fù)3次。1.3統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)用x±s表示,用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理,采用單因素方差分析兩組的均數(shù)比較采用S-N-K方法進行，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1LPS對VSMCs增殖的影響0.1mg·L-1、1
