三七皂苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響.doc

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1、三七皂苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響【摘要】目的：研究三七皂苷(PNS)對(duì)腦缺血再灌注后大鼠腦海馬和皮質(zhì)形態(tài)學(xué)變化、Bcl2、Bax蛋白表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。方法：采用線栓改良法復(fù)制大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)建立局灶性腦缺血再灌注損傷模型，缺血2小時(shí)，再灌注24小時(shí)。將50只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、三七皂苷組、尼莫地平組和三七皂苷加尼莫地平組（聯(lián)合用藥組），每組10只。分別采用HE染色檢測(cè)大鼠腦組織皮質(zhì)和海馬區(qū)病理改變，TUNEL法檢測(cè)各組腦內(nèi)皮質(zhì)和海馬區(qū)細(xì)胞凋亡變化，免疫組化染色觀察各組大鼠

2、腦內(nèi)皮質(zhì)和海馬區(qū)Bcl2、Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果：與模型組相比，三七皂苷組、尼莫地平組、聯(lián)合用藥組大鼠光鏡下細(xì)胞損傷變性程度輕；細(xì)胞凋亡率下降（P均<0.01），三七皂苷組與尼莫地平組相比，細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著性差異（P>0.05），與聯(lián)合用藥組相比，有顯著性差異（P<0.01）；與模型組相比，三七皂苷組、尼莫地平組、聯(lián)合用藥組大鼠缺血區(qū)皮質(zhì)和海馬Bcl2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯上升（P均<0.01），Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)在相同時(shí)間點(diǎn)減少（P均<0.01）。結(jié)論：三七皂苷可抑制大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷

3、有一定保護(hù)作用,其機(jī)制可能與Bcl2表達(dá)增高,Bax表達(dá)降低有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】大鼠腦缺血再灌注細(xì)胞凋亡Bcl2Bax三七皂苷缺血性中風(fēng)是最常見(jiàn)的腦血管疾病，缺血再灌注損傷所致神經(jīng)細(xì)胞凋亡已被證實(shí),但其發(fā)生機(jī)制仍未完全明確。三七為五加科多年生草本植物三七Panaxnotoginseng(Burk)F.H.Chen的根，主要活性成分是三七總皂苷(Panaxnotoginoside,PNS),其塊根中含皂苷約12%[1]。三七在缺血缺氧性腦損傷防治中廣泛應(yīng)用,但其對(duì)腦缺血再灌注后海馬和皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Bcl2、Bax表達(dá)的影響報(bào)道較少。

4、本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察三七皂苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)和海馬區(qū)細(xì)胞凋亡及Bcl2、Bax蛋白表達(dá)的影響，探討其抗腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。1實(shí)驗(yàn)材料1.1動(dòng)物及分組健康SD大鼠50只,雌雄不拘，清潔級(jí)，體重250～300g，由中英合資上海西普爾—必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）20030002]，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院動(dòng)物房[動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室許可證號(hào)為SYXK（滬）20052008]。大鼠經(jīng)普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為模型組、假手術(shù)組、三七皂苷組、尼莫地平組、三七皂苷合尼莫地平組（聯(lián)合用藥組）,每組10

5、只。1.2藥物及試劑三七皂苷注射液（昆明制藥集團(tuán)股份有限公司，商品名：血塞通注射液，規(guī)格：250mg/5ml/支），尼莫地平注射液（德國(guó)拜耳醫(yī)藥保健股份公司,規(guī)格：10mg/50ml/支）；免疫組化檢測(cè)試劑盒Bcl2、Bax抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），TUNEL試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。51.3主要儀器LeicaRM20型石蠟切片機(jī)，PhilipsTecnai12Biotwin型電子顯微鏡，MIQAS型病理圖像分析儀，SD78雙極電凝器。2實(shí)驗(yàn)方法2.1給藥方法及劑量根據(jù)人體臨床用藥劑量換算大鼠用藥劑量（相當(dāng)

6、于人體用藥量的6.3倍）。三七皂苷組給予三七皂苷45mg/kg；尼莫地平組給予尼莫地平20mg/kg；聯(lián)合用藥組給予三七皂苷45mg/kg，加尼莫地平20mg/kg；假手術(shù)組和模型組給予相同體積的生理鹽水。造模前6天給予腹腔注射上述劑量藥物,第7天給藥30min后造模,1天1次，造模后2小時(shí)給藥1次。給藥期間常規(guī)自由喂養(yǎng)、給水。2.2大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的制備及篩選2.2.1模型制備采用改良Longa[1]線栓法制備模型。腹腔注射10%戊巴比妥鈉(0.2ml/100g)麻醉，背位固定大鼠后，剃除頸部體毛，局部消毒。切開(kāi)頸正中皮膚3c

7、m，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，自CCA分叉處向頭端依次游離，雙極電凝器燙掉頸外動(dòng)脈(ECA)的細(xì)小分支，然后在頸外動(dòng)脈距頸總動(dòng)脈分叉0.5～1cm處結(jié)扎，切斷ECA，并使其游離并套線備用。分離頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)至顱底,分離其分支翼腭動(dòng)脈，如不分離夾閉，尼龍線可能進(jìn)入這個(gè)分支。用動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉左側(cè)CCA和翼腭動(dòng)脈,用彈簧剪在游離的ECA殘端剪0.2mm小口,將預(yù)先制備好的40的強(qiáng)生尼龍線(直徑0.20mm,長(zhǎng)50mm)入ECA殘端小口內(nèi),將尼龍線緩慢沿ICA向顱內(nèi)推進(jìn),進(jìn)線約22mm,略感阻力，證明栓線頭端已達(dá)到大腦前動(dòng)脈,阻斷了大腦中

8、動(dòng)脈的所有血液來(lái)源，包括來(lái)自頸內(nèi)動(dòng)脈、大腦前動(dòng)脈、大腦后動(dòng)脈的血流，縫合切口。將尼龍線留置2個(gè)小時(shí)后，再灌注24小時(shí)將栓線抽出約10mm,拔線時(shí)有脫空感即止，將遠(yuǎn)端剪斷10mm，以防動(dòng)物蘇醒后