三七皂苷對大鼠腦缺血再灌注損傷細胞凋亡及相關基因表達的影響

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　　三七皂苷對大鼠腦缺血再灌注損傷細胞凋亡及相關基因表達的影響【摘要】目的：研究三七皂苷(PNS)對腦缺血再灌注后大鼠腦海馬和皮質形態(tài)學變化、Bcl2、Bax蛋白表達及神經(jīng)細胞凋亡的影響。方法：采用線栓改良法復制大鼠左側大腦中動脈閉塞(MCAO)建立局灶性腦缺血再灌注損傷模型，缺血2小時，再灌注24小時。將50只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、三七皂苷組、尼莫地平組和三七皂苷加尼莫地平組（聯(lián)合用藥組），每組10只。分別采用HE染色檢測大鼠腦組織皮質和海馬區(qū)病理改變，TUNEL法檢測各組腦內皮質和海馬區(qū)細胞凋亡變化，免疫組化染色觀察各組大鼠腦內皮質和海馬區(qū)Bcl2、Bax蛋白表達。結果：與模型組相比，三七皂苷組、尼莫地平組、聯(lián)合用藥組大鼠光鏡下細胞損傷變性程度輕；細胞凋亡率下降（P均<0.01），三七皂苷組與尼莫地平組相比，細胞凋亡率無顯著性差異（P>0.05），與聯(lián)合用藥組相比，有顯著性差異（P<0.01）；與模型組相比，三七皂苷組、尼莫地平組、聯(lián)合用藥組大鼠缺血區(qū)皮質和海馬Bcl 2陽性細胞數(shù)均明顯上升（P均<0.01），Bax陽性細胞數(shù)的表達在相同時間點減少（P均<0.01）。結論：三七皂苷可抑制大鼠神經(jīng)細胞凋亡，對大鼠腦缺血再灌注損傷有一定保護作用,其機制可能與Bcl2表達增高,Bax表達降低有關?！娟P鍵詞】大鼠腦缺血再灌注細胞凋亡Bcl2Bax三七皂苷缺血性中風是最常見的腦血管疾病，缺血再灌注損傷所致神經(jīng)細胞凋亡已被證實,但其發(fā)生機制仍未完全明確。三七為五加科多年生草本植物三七Panaxnotoginseng(Burk)F.H.Chen的根，主要活性成分是三七總皂苷(Panaxnotoginoside,PNS),其塊根中含皂苷約12%[1]。三七在缺血缺氧性腦損傷防治中廣泛應用,但其對腦缺血再灌注后海馬和皮質神經(jīng)細胞凋亡及Bcl2、Bax表達的影響報道較少。本實驗通過觀察三七皂苷對腦缺血再灌注大鼠缺血側皮質和海馬區(qū)細胞凋亡及Bcl2、Bax蛋白表達的影響，探討其抗腦缺血再灌注損傷的作用機制。1實驗材料1.1動物及分組健康SD大鼠50只,雌雄不拘，清潔級，體重250～300g，由中英合資上海西普爾—必凱實驗動物有限公司提供[動物許可證號：SCXK（滬）20030002]，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院動物房[動物實驗室許可證號為SYXK（滬）2005 2008]。大鼠經(jīng)普通飼料適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為模型組、假手術組、三七皂苷組、尼莫地平組、三七皂苷合尼莫地平組（聯(lián)合用藥組）,每組10只。1.2藥物及試劑三七皂苷注射液（昆明制藥集團股份有限公司，商品名：血塞通注射液，規(guī)格：250mg/5ml/支），尼莫地平注射液（德國拜耳醫(yī)藥保健股份公司,規(guī)格：10mg/50ml/支）；免疫組化檢測試劑盒Bcl2、Bax抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司），TUNEL試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。1.3主要儀器LEicaRM20型石蠟切片機，PhilipsTeai12Biotg/kg；尼莫地平組給予尼莫地平20mg/kg；聯(lián)合用藥組給予三七皂苷45mg/kg，加尼莫地平20mg/kg；假手術組和模型組給予相同體積的生理鹽水。造模前6天給予腹腔注射上述劑量藥物,第7天給藥30min后造模,1天1次，造模后2小時給藥1次。給藥期間常規(guī)自由喂養(yǎng)、給水。2.2大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的制備及篩選2.2.1模型制備 采用改良Longa[1]線栓法制備模型。腹腔注射10%戊巴比妥鈉(0.2ml/100g)麻醉，背位固定大鼠后，剃除頸部體毛，局部消毒。切開頸正中皮膚3cm，暴露左側頸總動脈(CCA)，自CCA分叉處向頭端依次游離，雙極電凝器燙掉頸外動脈(ECA)的細小分支，然后在頸外動脈距頸總動脈分叉0.5～1cm處結扎，切斷ECA，并使其游離并套線備用。分離頸內動脈(ICA)至顱底,分離其分支翼腭動脈，如不分離夾閉，尼龍線可能進入這個分支。用動脈夾暫時夾閉左側CCA和翼腭動脈,用彈簧剪在游離的ECA殘端剪0.2mm小口,將預先制備好的40的強生尼龍線(直徑0.20mm,長50mm)入ECA殘端小口內,將尼龍線緩慢沿ICA向顱內推進,進線約22mm,略感阻力，證明栓線頭端已達到大腦前動脈,阻斷了大腦中動脈的所有血液來源，包括來自頸內動脈、大腦前動脈、大腦后動脈的血流，縫合切口。將尼龍線留置2個小時后，再灌注24小時將栓線抽出約10mm,拔線時有脫空感即止，將遠端剪斷10mm，以防動物蘇醒后將線栓抓脫，導致大出血死亡。假手術組僅做頸動脈分離。2.2.2動物模型成功標準動物蘇醒后，觀察缺血動物的神經(jīng)功能缺失癥狀。按Longa5分制評分:0分，無明顯神經(jīng)病學癥狀；1分，不能完全伸展對側前肢；2分，向對側旋轉；3分,行走時向對側傾倒；4分，不能自行行走，有意識障礙。0、4分棄之不用,其他即為成功模型。2.3標本取材再灌注24小時后過量麻醉，迅速開胸暴露心臟，經(jīng)升主動脈插管后灌注生理鹽水250ml剪開右耳,快速沖洗，再用4%多聚甲醛250ml灌注,直到頭部變硬,斷頭取腦,取視交叉前后約20～30mm范圍的冠狀切片，放入10%福爾馬林中固定，24小時之內石蠟包埋。2.4大腦皮質和海馬病理學觀察 腦組織經(jīng)10%福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋，切片3μm厚度,常規(guī)HE染色,光鏡下觀察。2.5免疫組化染色法切片脫蠟置新鮮配置的3%H2O2，室溫處理20min以滅活內源性過氧化物酶。將切片浸入0．01MPBS緩沖液中輕微振蕩洗滌3次，每次5min。滴加復合消化工作液至切片上，室溫孵育20min；以修復液Ⅰ覆蓋組織切片20min，使抗原充分暴露。將切片浸入0．01MPBS緩沖液中輕微振蕩洗滌3次，每次5min。滴加封閉液Ⅰ，室溫處理20min后洗滌。滴加特異性一抗(bcl2，1∶100)。37℃濕盒孵育2小時。0．01MPBS緩沖液中輕微振蕩洗滌3次，每次5min。滴加封閉液Ⅱ，室溫處理20min，0．01MPBS緩沖液中輕微振蕩洗滌3次，每次5min。滴加特異性生物素化二抗(1∶100)，37℃濕盒孵育2小時。0．01MPBS緩沖液中輕微振蕩洗滌3次，每次5min。滴加SABC過氧化酶復合物，4℃濕盒過夜。0．01MPBS緩沖液中輕微振蕩洗滌3次，每次5min。滴加DABH2O2顯色液顯色。蘇木素輕度復染，酒精梯度脫水，二甲苯透明，樹脂封片。實驗用PBS緩沖液替代一抗作為陰性對照，以細胞漿棕黃色為陽性。采用圖像分析儀，每組分析10個標本，每張切片在200倍光鏡下隨機選取5個不重疊的視野計皮質和海馬區(qū)陽性細胞數(shù)，取平均值。 2．6TUNEL細胞凋亡檢測將石蠟包埋標本行冠狀切片，厚3μm，按試劑盒說明書進行操作。光鏡下凋亡細胞核呈棕色。每張切片在200倍光鏡下隨機選取5個不重疊的視野，輸入計算機進行圖象分析，計算每個視野的凋亡細胞個數(shù)和正常細胞數(shù)，計算出細胞凋亡指數(shù)，取平均值。2．7統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)用SPSS13．0統(tǒng)計軟件分析處理，實驗數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析(ANOVA檢驗)，方差齊者組間比較用LSD檢驗，方差不齊者用GamesHocl1、AL。一般認為，Bcl2基因家族是一種重要的內源性抗凋亡因子，對維持腦缺血再灌注后某些神經(jīng)細胞的生存有重要作用。Bax蛋白存在于胞漿，是一種跨膜蛋白，含有192個氨基酸，與Bcl2具有21％的同源性，其生物學作用是拮抗Bcl2。三七具有化瘀止血、活血定痛之效。《本草綱目》記載該藥可散血、止血、定痛。藥理研究認為，三七活性成分為三七總皂苷(PNS),具有擴張微細血管,降低血管阻力,增加腦血流量,降低血液黏度,抑制血栓形成等作用。本實驗結果顯示,HE染色光鏡下觀察，三七皂苷組腦組織損傷程度均較模型組輕,免疫組化染色結果表明,模型組Bcl2有表達，Bax與之相反,與