淺析新基因NOR1對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響

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1、淺析新基因NOR1對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響【摘要】　　目的:研究NOR1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞系HepG2蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響。方法:將(+)/NOR1的表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體導(dǎo)入HepG細(xì)胞,Northernblot篩選出陽性克隆,通過雙向電泳分離過表達(dá)NOR1的HepG2細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì),篩選出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn),并進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定。結(jié)果:鑒定出6種表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn),包括鋅指蛋白、腫瘤壞死因子受體、酪氨酸蛋白磷酸化受體等,這些蛋白質(zhì)涉及基因轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等腫瘤發(fā)生相關(guān)事件。結(jié)論:NOR1基因可能通過

2、上調(diào)這些蛋白參與多種途徑影響肝癌的發(fā)生發(fā)展。【關(guān)鍵詞】NOR1基因雙向電泳基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜硝基還原酶基因NOR1是課題組克隆的一個(gè)與亞硝胺類化合物致癌密切相關(guān)的新基因[1],GenBank登錄號(hào)為AF462348。人體多組織Northernblot表達(dá)分析顯示NOR1基因在所檢測的肝、腦、腎、肺、脾臟、骨骼肌等12種正常組織中廣泛表達(dá),且有2個(gè)轉(zhuǎn)錄本(1600bp,1200bp)[2]。通過構(gòu)建NOR1基因真核表達(dá)載體及NOR1基因轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)NOR1基因轉(zhuǎn)染可引起IL

3、8的表達(dá)升高[3,]。為了深入研究NOR1基因功能,本試驗(yàn)運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)NOR1基因肝癌細(xì)胞系HepG2,采用高通量的蛋白質(zhì)組技術(shù)研究過表達(dá)NOR1肝癌細(xì)胞系HepG2后蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改變,通過對(duì)差異蛋白點(diǎn)的鑒定與分析,探討NOR1基因在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用?！?材料和方法材料人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞由中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院檢驗(yàn)科保存;(+)載體為哺乳動(dòng)物高效表達(dá)載體,為Invitrogen公司的產(chǎn)品;(+)/NOR1載體由中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院檢驗(yàn)科構(gòu)建;隨機(jī)引物標(biāo)記盒購自美國Promega公

4、司;TRIzolTM試劑購自美國Gibcol/BRL公司;蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)標(biāo)準(zhǔn)購自中科院上海生物化學(xué)研究所;同位素α32pdCTP、α33pdATP,購自北京福瑞公司;引物由大連寶生物有限公司合成;固相pH梯度干膠條、載體兩性電解質(zhì)、IPG緩沖液、覆蓋液、石蠟油、銀染試劑盒、IPGphor電泳單元及雙向電泳附件、EPS500電源、重泡脹附件和循環(huán)水浴箱等電聚焦系統(tǒng)、IPGPhor電泳系統(tǒng)等購自Pharmacia公司;丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰胺為國產(chǎn)分析純;乙腈為國產(chǎn)色譜純;其他試劑為

5、國產(chǎn)分析純?cè)噭?垂直平板電泳系統(tǒng)、循環(huán)水浴箱購自BioRad公司;PDQUESTD膠分析系統(tǒng)購自BioRad公司。方法(+)/NOR1/HepG2穩(wěn)定表達(dá)系的建立方法詳見文獻(xiàn)[3]。上游引物為5′ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGCT3′,下游引物為5′TCTCAGCCCTCTTTCAAAAACTTCTC3′;為了進(jìn)一步驗(yàn)證穩(wěn)定細(xì)胞系的建立,我們還使用Northernblot方法進(jìn)行了驗(yàn)證,方法見分子克隆操作。蛋白抽提與定量細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期,棄出培養(yǎng)液,用胰酶消化,PBS洗

6、后約2×106細(xì)胞中加入50μL裂解液,液氮反復(fù)凍融后,加20μLRNase(20g/L)在4℃放置1min,13000r/min,℃離心30min,收集上清液,樣品存放-70℃。蛋白定量用BSA方法操作,每次上樣量為300mg。等電聚焦電泳及銀染采用IPGphor等電聚焦系統(tǒng),把干膠條置于膠條盒中放置在IPGphor電泳儀上水化15～1h,水化完畢按500V,1000V各1h,000Vh等電聚焦聚焦結(jié)束后,取出膠條,加入平衡液A振蕩平衡1min,再換平衡液B(mol/Lurea,/LTrisHCl

7、,0g/LSDS,00g/L甘油,1g/L碘乙酰胺)振蕩平衡1min,取出膠條濾干。第二向SDSPAGE基本上按照Bjellguist的方法進(jìn)行。采用分離膠濃度為1g/L的不連續(xù)SDSPAGE垂直平板電泳。銀染按銀染試劑盒操作手冊(cè)操作。圖像分析通過PDQuestD分析軟件系統(tǒng),分別比較4次重復(fù)結(jié)果圖譜,將HepG2和轉(zhuǎn)染NOR1細(xì)胞的進(jìn)行匹配分析,獲得NOR1基因轉(zhuǎn)染所致的蛋白質(zhì)差異表達(dá)變化,將這些蛋白點(diǎn)在雙向電泳凝膠圖譜上標(biāo)出。蛋白質(zhì)的原位酶解蛋白質(zhì)原位酶解按Fernandez[5]和Ghar

8、ahdaghi[6]的方法進(jìn)行。MADLITOF肽質(zhì)指紋圖分析在樣品中加入10μL1g/LTFA水溶液,振蕩,使樣品充分溶解,再用美國Millipore公司的10μLZipTipTMC18器嘴脫鹽。制備好的樣品使用美國BRUKER公司的ProFlexTMIIIMADLITOF質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。2結(jié)果.1陽性克隆的鑒定將挑選出來的單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng),抽提RNA進(jìn)行RTPCR鑒定。共挑選出8個(gè)單克隆細(xì)胞,用RTPCR鑒定,其中有4個(gè)為陽性克隆。為了進(jìn)一